Mandibular Murine Modelinde Ortodontik Diş Hareketi Sırasında PDL Kollajen Liflerinin 3D Görüntülenmesi
Summary
Farelerde ortodontik diş hareketi oluşturmak için bir protokol ve periodontal ligamentin kollajen liflerinin ve kan damarlarının bölümlenmeden 3D görselleştirilmesi için yöntemler sunuyoruz.
Abstract
Ortodontik diş hareketi, dış kuvvetlerin bir sonucu olarak değiştirilmiş yumuşak ve sert doku tadilatının karmaşık bir biyolojik sürecidir. Bu karmaşık tadilat süreçlerini anlamak için diş ve periodontal dokuların 3D bağlamlarında incelenmesi ve bu nedenle herhangi bir kesit ve doku yapıtının en aza indirilmesi kritik öneme sahiptir. Fare modelleri genellikle gelişimsel ve yapısal biyolojinin yanı sıra küçük boyutları, yüksek metabolizma hızları, genetikleri ve kullanım kolaylığı nedeniyle biyomekanikte de kullanılır. Prensip olarak bu aynı zamanda onları dişle ilgili çalışmalar için mükemmel modeller yapar. Bununla birlikte, büyük bir engel, küçük diş boyutları, özellikle azı dişleridir. Bu makale, ortodontik diş hareketinin oluşturulması için adım adım bir protokol ve bir fare mandibular azı dişinin periodontal ligament fibrus bileşeninin 3D görüntülenmesi için iki yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Sunulan ilk yöntem, taze kollajen dokuların faz geliştirme görüntülemesini sağlayan bir mikro-BT kurulumuna dayanmaktadır. İkinci yöntem, kesit olmadan kemikten görüntülemeyi sağlayan ve endojen floresanları koruyan etil cinnamat kullanan bir kemik temizleme yöntemidir. Bu temizleme yöntemini Flk1–Cregibi muhabir farelerle birleştirmek; TdTomato, PDL ve alveolar kemikteki 3D vaskülatları görüntüleme fırsatı sağladı.
Introduction
Ortodontik diş hareketinde (OTM) altta kalan temel biyolojik süreç kemik tadilatıdır. Bu tadilat işleminin tetikleyicisi, periodontal ligamentin (PDL) yapısındaki hücreler arası matris (ECM) stresi, nekroz, kan damarı yıkımı ve oluşumu 1 ,2,3gibideğişikliklereatfedilir. Alveolar kemik tadilatı için diğer olası tetikleyiciler, kemikteki osteositler tarafından zorla algılamanın yanı sıra alveolar kemiğin kendisinin mekanik deformasyonu ile ilgilidir; ancak OTM’deki rolleri hala tam olarak aydınlatılmamıştır4,5.
OTM sırasında PDL’nin yapı-işlev ilişkilerini ortaya çıkarmayı amaçlayan birçok çalışmaya rağmen, net bir fonksiyonel mekanizma henüz tanımlanmamıştır6,7. Bunun başlıca nedeni, iki sert doku (çimento ve alveolar kemik) arasında bulunan yumuşak bir dokunun (PDL) verilerinin alınarak ele geçirildir. Yapısal bilgi toplamak için kabul edilen yöntemler genellikle PDL yapısını bozan ve değiştiren sabitleme ve bölümleme gerektirir. Ayrıca, bu yöntemlerin çoğu, bozulmamış olsa bile, yalnızca kısmi ve yerelleştirilmiş bilgiler veren 2D veriler sağlar. PDL yapısında ve işlevinde tekdüze olmadığından, tüm diş-PDL-kemik kompleksinin sağlam 3D yapısını ele alan bir yaklaşım garanti edilir.
Bu makalede, farelerde bir OTM oluşturmak için bir yöntem ve pdl’deki kollajen liflerinin numunenin herhangi bir bölümü olmadan 3D görselleştirilmesini sağlayan iki yöntem açıklanmaktadır.
Murine modelleri tıp, gelişim biyolojisi, ilaç teslimi ve yapısal çalışmalarda in-vivo deneyler için yaygın olarak kullanılmaktadır. Belirli proteinleri ve fonksiyonları ortadan kaldırmak veya geliştirmek için genetik olarak değiştirilebilirler; hızlı, tekrarlanabilir ve öngörülebilir gelişimsel kontrol sağlarlar; ayrıca küçük boyutları nedeniyle görüntüleri kolaydır8. Birçok avantajlarına rağmen, diş araştırmalarındaki fare modelleri, özellikle klinik manipülasyonlar garanti edildiğinde, çoğunlukla küçük boyutlu dişler nedeniyle sık kullanılmaz. Sıçanlar9,10,11,köpekler12,13,domuzlar14 , 15,16ve maymunlar17 gibi hayvan modelleri farelerden daha sık kullanılır. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinin son zamanlarda gelişmesiyle, OTM’deki dolambaçlı süreçleri çözmek için bir fare modeli kullanmanın avantajları çoktur. Bu makale, kemik tadilatını tetikleyen sabit kuvvet seviyelerine sahip mandibuladaki azı dişinin mesial hareketini oluşturmak için bir yöntem sunun. Kemirgenlerdeki OTM deneylerinin çoğu maksillada yapılır, çünkü mandibulanın hareketliliği ve dilin varlığı başka bir karmaşıklık seviyesi ekler. Bununla birlikte, 3D yapısal bütünlük istendiğinde mandibula birçok avantaja sahiptir. Bütün bir kemik olarak kolayca parçalanabilir; bazı türlerde lifli senfonik yoluyla iki hemi-mandibulaya ayrılabilir; kompakt, düzdür ve herhangi bir sinüs alanı olmayan sadece dişleri içerir. Buna karşılık, maksilla kafatasının bir parçasıdır ve diğer organlar ve yapılarla yakından ilgilidir, bu nedenle alveolar kemiği ilişkili dişlerle parçalamak için kapsamlı bir bölümleme gerekir.
Faz geliştirme sağlayan yüksek çözünürlüklü bir mikro BT içindeki bir yükleme sistemine bağlı bir ev içi nem odası kullanarak, daha önce açıklandığı gibi3Dtaze lifli dokuları görselleştirmek için bir yöntem geliştirdik 9 , 18,19,20,21,22,23. Taze dokular, hayvan herhangi bir lekelenme veya fiksasyon olmadan kurban edildikten hemen sonra taranır, bu da doku eserlerini ve biyomekanik özelliklerin değişikliklerini azaltır. Bu 3D veriler, başka bir yerde açıklandığı gibi liflerin dağıtım ve yön analizleri için kullanılabilir19.
Burada sunulan ikinci 3D tüm doku görüntüleme yöntemi, PDL liflerinin herhangi bir kesit olmadan kemik yoluyla görüntülenmesini sağlayan mandibulanın optik olarak temizlenmesine dayanmaktadır. İlginçtir ki, kemiğin kollajen liflerinin görselleştirilmesini de sağlar, ancak bu burada tartışılmaz. Genel olarak, doku temizleme için iki yöntem vardır. Birincisi, numunenin basit bir daldırma, hiperhidrasyon veya hidrojel gömme yoluyla 1,4’ten büyük bir kırılma indeksine sahip sulu bir çözeltiye batırıldığı sulu bazlı temizlemedir. Bununla birlikte, bu yöntem şeffaflık düzeyinde olduğu kadar dokunun yapısal korunmasında da sınırlıdır ve bu nedenle dokunun sabitlenerek yapılmasını gerektirir. Son derece şeffaf numuneler veren ve fiksasyon gerektirmeyen ikinci yöntem solvent bazlı temizleme yöntemi24,25. Mandibular numuneler için etil-3-fenilprop-2-enoate (etil cinnamat, ECi) bazlı modifiye solvent bazlı bir temizleme yöntemi oluşturduk. Bu yöntem toksik olmayan gıda sınıfı temizleme maddesi, minimum doku büzülmesi ve floresan proteinlerin korunması avantajlarına sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Farelerde OTM üretmek, boyut, genetik ve elleçleme avantajları nedeniyle çok arzu edilir. Mandibulanın kullanılması hem doku diseksiyonu hem de numune hazırlama ve görüntüleme açısından kolay bir kullanım sağlar. Burada OTM’den sonraki 7 gün içinde dişin kemik içindeki çevirisel hareketi ile OTM üretmek için bir yöntem sunduk. Bu protokol kullanılarak, diş hareketinin genel süresi uzatılabilir, çünkü aktif bobin yaklaşık 1 mm’ye kadar hareket için sabit bir kuvvet seviyesi sağlar. Bunun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh) tarafından desteklenmiştir. Harvard Biyolojik Görüntüleme Merkezi’ne altyapı ve destek için teşekkür ederiz. Tüm rakamlar biorender.com ile oluşturulur.
Materials
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement–a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. d. A., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
