Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules fœtales du syndrome de Turner (45XO) pour la modélisation en aval des déficits neurologiques associés au syndrome

Summary

Ce protocole décrit la génération de CSI sans intégration à partir de fibroblastes de tissu fœtal par administration de plasmides épisomiques par nucléofection suivie d’une description des méthodes utilisées pour la caractérisation de l’iPSC et la différenciation neuronale.

Abstract

Les aneuploïdies chromosomiques provoquent de graves malformations congénitales, notamment des malformations du système nerveux central et la mort fœtale. Le dépistage génétique prénatal est purement diagnostique et n’élucide pas le mécanisme de la maladie. Bien que les cellules des fœtus aneuploïdes soient du matériel biologique précieux portant l’aneuploïdie chromosomique, ces cellules sont de courte durée, ce qui limite leur utilisation pour les expériences de recherche en aval. La génération de modèles de cellules souches pluripotentes induites (CSIp) est une méthode efficace de préparation cellulaire pour la conservation perpétuelle des caractères aneuploïdes. Ils se renouvellent d’eux-mêmes et se différencient en cellules spécialisées qui rappellent le développement embryonnaire. Ainsi, les CSPe constituent d’excellents outils pour étudier les événements de développement précoces. Le syndrome de Turner (TS) est une affection rare associée à un chromosome X complètement ou partiellement manquant. Le syndrome est caractérisé par l’infertilité, la petite taille, les troubles endocriniens, métaboliques, auto-immuns et cardiovasculaires et les défauts neurocognitifs. Le protocole suivant décrit l’isolement et la culture de fibroblastes à partir de tissu fœtal TS (45XO), la génération de TSiPSC sans intégration par l’administration de plasmides de reprogrammation épisomique par nucléofection suivie d’une caractérisation. Les TSiPSC de reprogrammation ont d’abord été examinés par coloration de la phosphatase alcaline des cellules vivantes, suivie d’un sondage approfondi pour les biomarqueurs de pluripotence. Les colonies sélectionnées ont été disséquées mécaniquement, ont été croisées plusieurs fois et des cellules stables auto-renouvelées ont été utilisées pour d’autres expériences. Les cellules ont exprimé les facteurs de transcription de pluripotence OCT4, NANOG, SOX2, les marqueurs de surface cellulaire SSEA 4 et TRA1-81 typiques des cellules souches pluripotentes. Le caryotype 45XO original a été conservé après la reprogrammation. Les TSiPSC ont pu former des corps embryoïdes et se différencier en cellules d’endoderme, de mésoderme et d’ectoderme exprimant des biomarqueurs spécifiques à la lignée ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Les plasmides épisomiques exogènes ont été perdus spontanément et non détectés après le passage 15 dans les cellules. Ces TSiPSC sont une ressource cellulaire précieuse pour modéliser le neurodéveloppement moléculaire et cellulaire défectueux provoquant des déficits neurocognitifs associés au syndrome de Turner.

Introduction

Les aneuploïdiens entraînent des malformations congénitales et des pertes de grossesse chez l’homme. ~ 50% à 70% des échantillons de pertes de grossesse présentent des anomalies cytogénétiques. Les embryons aneuploïdes perdus au début de la grossesse ne peuvent pas être facilement obtenus pour une analyse expérimentale, ce qui soulève la nécessité de développer d’autres modèles représentant étroitement l’embryogenèse humaine. Des cellules souches pluripotentes induites (CSI) dérivées de cellules diagnostiquées avec des troubles génétiques ont été utilisées pour modéliser les irrégularités génétiques représentatives et leurs conséquences sur le développement du fœtus^1,2,3,4. Ces CSPi ressemblent à des cellules épiblastiques de l’embryon en développement et peuvent récapituler les événements précoces de la formation de l’embryon. Ils permettent de comprendre et de caractériser le programme de développement des lignées cellulaires et des modèles chez les embryons de mammifères précoces. CSPi dérivées précédemment de fibroblastes cutanés et d’amniocytes provenant de tests de diagnostic prénatal de syndromes d’aneuploïdie comme la monosomie X (syndrome de Turner), la trisomie 8 (syndrome de Warkany 2), la trisomie 13 (syndrome de Patau) et la trisomie partielle 11; 22 (syndrome d’Emanuel) ont fourni des informations précieuses concernant l’échec du développement⁴.

Le syndrome de Turner (TS) est une maladie rare caractérisée par l’infertilité féminine, la petite taille, des troubles endocriniens et métaboliques, un risque accru de maladie auto-immune et une prédisposition aux maladies^{cardiovasculaires 5}. Bien qu’il s’agit du seul syndrome de monosomie survivable, il est également mortel pour l’embryon en développement provoquant des avortements spontanés⁶. Les individus survivants atteints de TS présentent des degrés d’altération du matériel chromosomique X dans leurs cellules. Les caryotypes vont de la perte complète d’un chromosome X (45,XO) à des mosaïques comme 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la présence de chromosomes annulaires, la présence de matériel chromosomique Y,^{etc. 5}.

Le diagnostic du syndrome se fait généralement par caryotypage du sang des individus symptomatiques et prélèvement de villosités chorioniques (CVS) pour détecter les syndromes d’aneuploïdie précoce. Étant donné que les syndromes d’aneuploïdie représentent environ 30% des avortements spontanés, il est courant de caryotyper le produit de la conception (POC) lors d’un avortement spontané. Ces cellules fœtales, y compris les villosités chorioniques possédant l’anomalie cytogénétique et les CSPi qui en sont dérivées, constituent une source précieuse de matériel biologique pour étudier les syndromes d’aneuploïdie^4,6. Les CSI TS ont déjà été établies à partir d’amniocytes via la reprogrammation rétrovirale^4,de fibroblastes de villosités chorioniques (obtenus par diagnostic prénatal) via une reprogrammation rétrovirale^6,de cellules mononucléaires sanguines⁷ via la reprogrammation du virus Sendai et de fibroblastes cutanés d’individus TS via une reprogrammation lentivirale⁴ . Étant donné que l’objectif principal de notre laboratoire est de comprendre l’échec du développement, nous avons généré des CST iPSC à partir de POC, en particulier la composante des villosités chorioniques d’un avortement spontané⁸. Toutes les cellules isolées de ce tissu fœtal avaient un caryotype 45XO et produisaient des CS IPC avec le même caryotype. Ces CSPe sont uniques car elles sont les premières à être générées à partir d’un fœtus avorté et constituent une ressource précieuse pour étudier les échecs de grossesse liés à l’aneuploïdie. Cet article fournit une méthodologie détaillée de la génération de CSPic à partir de cette source cellulaire unique via la reprogrammation épisomique.

Les premières méthodes de génération d’iPSC utilisaient la transduction virale et les transposons pour fournir les facteurs de reprogrammation. Les méthodes d’induction des cellules à la pluripotence ont évolué de l’intégration des vecteurs rétroviraux^9,des vecteurs lentiviraux excisables^10,11 et des méthodes basées sur les transposons¹² aux vecteurs adénoviraux non intégrateurs¹³ et aux vecteurs à base du virus Sendai^14. La reprogrammation rétrovirale et lentivirale, bien qu’efficace, implique l’intégration des facteurs de reprogrammation dans les chromosomes de l’hôte, provoquant des mutations d’insertion qui ont des effets imprévus dans les CSI. De plus, la reprogrammation virale empêche l’application translationnelle des CSI. Les systèmes à base d’ARN¹⁵ et d’administration directe de protéines¹⁶ ont été explorés pour éliminer complètement les risques potentiels associés à l’utilisation de virus et de transfections d’ADN. Cependant, ces méthodes se sont avérées inefficaces.

En 2011, Okita et al. ont rapporté une amélioration de l’efficacité de la reprogrammation par des plasmides épisomiques augmentés par la suppression de TP53 via shRNA. Ils ont également remplacé le cMYC par un LMYC (MYC associé au carcinome pulmonaire à petites cellules) non transformant pour améliorer la sécurité des hiPSC. Ces plasmides épisomiques expriment 5 facteurs de reprogrammation : OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC et shRNA pour TP53^17,18. Ces vecteurs sont maintenus extra-chromosomiquement et perdus des cellules reprogrammées lors d’une culture continue, rendant ainsi les lignes sans transgène dans 10-15 passages. La nucléofection est une forme spécialisée d’électroporation qui délivre des acides nucléiques directement dans le noyau des cellules hôtes. C’est une méthode efficace pour l’administration des plasmides de reprogrammation dans divers types de cellules. Les plasmides épisomiques sont rentables et compensent les coûts élevés de la nucléofection. Cette méthode est efficace et reproductible dans des conditions optimisées, produisant des CSP stables à partir d’une variété de cellules somatiques. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode de génération de CSI i à partir de fibroblastes isolés du tissu fœtal par nucléofection de plasmides de reprogrammation épisomique. Voici les protocoles détaillés pour l’isolement des fibroblastes des villosités chorioniques fœtales, la purification des plasmides, la nucléofection, la cueillette des colonies à partir de la plaque de reprogrammation et l’établissement de CSI stables.

Il est essentiel de confirmer la présence de traits de pluripotence dans les IPSC nouvellement générés. Cela comprend la démonstration de facteurs liés à la pluripotence (par exemple, expression de la phosphatase alcaline, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadhérine; généralement montré avec des tests d’immunofluorescence ou d’expression génique), l’identification des trois couches germinales par des tests de différenciation in vitro pour valider leurs potentiels de différenciation, le caryotypage pour déterminer le contenu chromosomique, le typage STR pour établir l’identité avec les cellules mères, vérifier la perte de gènes exogènes, et des essais in vivo plus rigoureux tels que la formation de tératome et la complémentation tétraploïde. Nous décrivons ici les protocoles de caractérisation du caryotypage, la coloration de la phosphatase alcaline des cellules vivantes, la détection de biomarqueurs liés à la pluripotence par immunofluorescence, les tests de différenciation in vitro et la méthode pour démontrer la perte de gènes exogènes¹⁹.

Protocol

Les FCV ont été obtenus de l’hôpital Manipal, à Bangalore, sous l’approbation du comité d’éthique des hôpitaux Manipal. REMARQUE : Voir le tableau 1 pour la composition de tous les tampons et solutions. 1. Isolement des fibroblastes des villosités chorioniques fœtales (FCV) Prélèvement d’échantillons et désintégration tissulaire dans la collagénase Recueillir le FCV dans d…

Representative Results

Génération de CSPe sans intégration à partir d’un fœtus avorté spontanément avec un caryotype 45XONous avons isolé des fibroblastes de FCV avec un caryotype 45XO spécifique du syndrome de Turner (TS) et les avons nucléofectés avec des plasmides de reprogrammation épisomique pour générer des TSiPSC qui peuvent être utilisés pour la modélisation en aval du syndrome, en particulier les déficits neurologiques associés(Figure 1a& b). Nous…

Discussion

La génération de modèles cellulaires stables de tissu fœtal cytogénétiquement anormal est nécessaire pour perpétuer un phénotype défectueux. La voie iPSC est la méthode la plus efficace de préparation cellulaire pour la conservation perpétuelle des propriétés défectueuses²⁰.

Les cellules souches pluripotentes (CSE) présentent des propriétés d’auto-renouvellement et de différenciation en cellules spécialisées qui rappellent les embryons de clivage…

Materials

0.15% trypsin	Thermo Fisher Scientific	27250018	G Banding
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023	Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole	Sigma Aldrich	D8417	Immunocytochemistry
Activin A	Sigma Aldrich	SRP3003	Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain	Thermo Fisher Scientific	A14353	AP staining
AMAXA Nucleofector II	Lonza	–	Nucleofection
AmnioMAX II complete media	Thermo Fisher Scientific, Gibco	11269016	Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin	HiMedia	TC021	Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11059	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15240096	Contamination control
Anti-E-Cadherin	BD Biosciences	610181	Immunocytochemistry
Anti-Nanog	BD Biosciences	560109	Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4	BD Biosciences	611202	Immunocytochemistry
Anti-SOX17	BD Biosciences	561590	Immunocytochemistry
Anti-SOX2	BD Biosciences	561469	Immunocytochemistry
Anti-SSEA4	BD Biosciences	560073	Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81	Millipore	MAB4381	Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]	Sigma Aldrich	F0291	Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4	Sigma Aldrich	SRP3016	Differentiation assays
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A3059	Blocking
Collagen Human Type IV	BD Biosciences	354245	Differentiation assays
Collagenase blend	Sigma Aldrich	C8051	Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	Differentiation assays
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	11320033	Differentiation assays
FastDigest EcoR1	Thermo Scientific	FD0274	Restriction digestion
Fibronectin	Sigma Aldrich	F2518	Differentiation assays
Giemsa Stain	HiMedia	S011	G Banding
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS001	Fixative for karyotyping
Glucose	Sigma Aldrich	G7528	Differentiation assays
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium	Sigma Aldrich	H3149	Differentiation assays
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278	Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite	Sigma Aldrich	I1884	Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit	Kapa Biosystems	KR0368	OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid	Thermo Fisher Scientific	15210040	Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	10829018	Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar	HiMedia	M1151F	Plasmid purification
Matrigel	BD Biosciences	356234	Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140035	Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol	HiMedia	MB113	Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β	Millipore	MAB1552	Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit	Lonza	VAPD-1001	Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F	Addgene	27077	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK	Addgene	27078	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL	Addgene	27080	Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific,	15070063	Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma Aldrich	P1951	Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417	1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep	QIAGEN	12143	Plasmid purification
Potassium Chloride Solution	HiMedia	MB043	Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit	Qiagen	51104	Genomic DNA isolation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875093	Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate	HiMedia	RM255	Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100	HiMedia	MB031	Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermo Fisher Scientific, Gibco	25300054	Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20	HiMedia	MB067	Preparation of PBST
β III tubulin	Sigma Aldrich	T8578	Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride	Sigma Aldrich	Y0503	Differentiation assays