דור תאי גזע פלוריפוטנטים מושרים מתסמונת טרנר (45XO) תאים עובריים למידול במורד הזרם של ליקויים נוירולוגיים הקשורים לתסמונת
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הדור של IPSCs חינם אינטגרציה מפיברובלסטים רקמת העובר באמצעות משלוח של plasmids אפיזומלי על ידי נוקלאופקטציה ואחריו תיאור של שיטות המשמשות לאפיון IPSC ובידול עצבי.
Abstract
aneuploidies כרומוזומלי לגרום מומים מולדים חמורים כולל מומים במערכת העצבים המרכזית ומוות עוברי. הקרנה גנטית טרום הנדסית היא אבחון גרידא ואינה מזרזת מנגנון מחלה. למרות שתאים מעוברים אנופלואידיים הם חומר ביולוגי בעל ערך הנושא את האנופלואידיה הכרומוזומלית, תאים אלה קצרי מועד, ומגבילים את השימוש בהם לניסויים מחקריים במורד הזרם. יצירת מודלים של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC) היא שיטה יעילה להכנת תאים לשימור תמידי של תכונות aneuploid. הם מחדשים את עצמם ומבדילים לתאים מיוחדים המזכירים התפתחות עוברית. לכן, IPSCs לשמש כלים מצוינים ללמוד אירועים התפתחותיים מוקדמים. תסמונת טרנר (TS) היא מצב נדיר הקשורים כרומוזום X חסר לחלוטין או חלקית. התסמונת מאופיינת באי פוריות, קומתו הקצרה, האנדוקרינית, המטבולית, הפרעות אוטואימוניות וקרדיווסקולריות ופגמים נוירו-קוגניטיביים. הפרוטוקול הבא מתאר בידוד ופולחן של פיברובלסטים מרקמת עובר TS (45XO), יצירת TSiPSCs ללא שילוב באמצעות משלוח של פלסמידים לתכנות מחדש אפיזומלי על ידי נוקלאופקטציה ואחריו אפיון. TSiPSCs תכנות מחדש הוקרנו בתחילה על ידי כתמי פוספטאז תא חי ואחריו בדיקה נרחבת עבור סמנים ביולוגיים pluripotency. מושבות נבחרות נותחו באופן מכני, עברו מספר פעמים ותאים יציבים המתחדשים העצמית שימשו לניסויים נוספים. התאים הביעו גורמי שעתוק pluripotency OCT4, NANOG, SOX2, סמני פני השטח של התא SSEA 4 ו TRA1-81 אופייני לתאי גזע פלוריפוטנטים. קריוטיפ 45XO המקורי נשמר לאחר תכנות מחדש. ה- TSiPSCs הצליחו ליצור גופים עובריים ולהבדיל לתאים של אנדודרם, מסודרם וקטודרם המבטאים סמנים ביולוגיים ספציפיים לשושלת (SRY BOX17), (MYOSIN חדרית כבד צ’אי נין/β), (βIII TUBULIN)). הפלסמידים האפיזומליים האקסוגניים אבדו באופן ספונטני ולא זוהו לאחר מעבר 15 בתאים. TSiPSCs אלה הם משאב תאי יקר ערך עבור דוגמנות מולקולרית פגומה נוירו-פיתוח תאי גרימת ליקויים נוירו-קוגניטיביים הקשורים תסמונת טרנר.
Introduction
Aneuploidies להוביל מומים מולדים / מומים מולדים ואובדן הריון בבני אדם. ~ 50%-70% מהדגימות מאובדן הריון מראות חריגות ציטוגנטיות. עוברים Aneuploid שאבדו בשלב מוקדם של ההריון לא ניתן להשיג בקלות לניתוח ניסיוני מעלה את הצורך לפתח מודלים אחרים המייצגים מקרוב עוברי אדם. תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSCs) הנגזרים מתאים שאובחנו עם הפרעות גנטיות שימשו כדי לדגמן את אי סדרים גנטיים מייצגים ואת התוצאה שלהם על התפתחות העובר1,2,3,4. IPSCs אלה דומים לתאי אפיבלסט של העובר המתפתח ויכולים לשחזר את האירועים המוקדמים של היווצרות העובר. הם מאפשרים הבנה ואפיון של התוכנית ההתפתחותית של שושלות התאים ודפוסים בעוברים יונקים מוקדמים. IPSCs נגזר בעבר פיברובלסטים בעור מי השפיר מבדיקות אבחון טרום לידה של תסמונות aneuploidy כמו מונוזומיה X (תסמונת טרנר), טריזומיה 8 (תסמונת Warkany 2), טריזומיה 13 (תסמונת פאטאו) וטריזומיה חלקית 11; 22 (תסמונת עמנואל) סיפקו תובנות חשובות לגבי התפתחות כושלת4.
תסמונת טרנר (TS) היא מצב נדיר המאופיין באי פוריות נשית, קומתו הקצרה, הפרעות אנדוקריניות ומטבוליות, סיכון מוגבר למחלות אוטואימוניות, נטייה למחלות לב וכלי דם5. למרות שזו התסמונת המונוסומית היחידה ששרדה, היא קטלנית גם לעובר המתפתח הגורמת להפלות ספונטניות6. אנשים ששרדו עם TS נוכחים עם דרגות של שינוי של חומר X-כרומוזומלי בתאים שלהם. קריוטיפים נעים בין אובדן מוחלט של כרומוזום X אחד (45,XO) לפסיפסים כמו 45,XO/46,XX; 45, XO/47, XXX, נוכחות של כרומוזומי טבעת, נוכחות של חומר Y-כרומוזומלי, וכו‘5.
אבחון התסמונת נעשה בדרך כלל על ידי דם קריוטיפינג של אנשים סימפטומטיים ודגימת villi כוריוני (CVS) כדי לזהות תסמונות aneuploidy מוקדם. מאז תסמונות aneuploidy מהווים ~ 30% של הפלות ספונטניות, זה שגרתי קריוטיפ המוצר של התעברות (POC) על הפלה ספונטנית. תאים עובריים אלה כולל villi chorionic בעל חריגות ציטוגנטית IPSCs נגזר מהם לספק מקור יקר של חומר ביולוגי כדי ללמוד תסמונות aneuploidy4,6. TS iPSCs הוקמו בעבר ממי השפיר באמצעות תכנות מחדש רטרו-ויראלי4, פיברובלסטים של villi כוריוני (המתקבל באמצעות אבחון טרום היילוד) באמצעות תכנות מחדש רטרו-ויראלי6, מתאי מונונוקלאריים בדם7 באמצעות תכנות מחדש של וירוס סנדאי ומפיברובלסטים בעור של אנשים TS באמצעות תכנות מחדש lentiviral4 . מאז המוקד העיקרי של המעבדה שלנו היא להבין כישלון התפתחותי, יצרנו IPSCs TS מ POC, במיוחד את רכיב villi כוריוני של הפלה ספונטנית8. כל התאים המבודדים מרקמת העובר הזו היו בעלי קריוטיפ של 45XO והניבו IPSCs עם אותו קריוטיפ. IPSCs אלה הם ייחודיים כפי שהם הראשונים שנוצר מעובר שהופלה ולספק משאב יקר לחקר כשלי הריון הקשורים aneuploidy. מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת של יצירת IPSCs ממקור תא ייחודי זה באמצעות תכנות מחדש אפיזומלי.
השיטות המוקדמות של דור iPSC השתמשו בהעברת נגיפים ותמרות כדי לספק את גורמי התכנות מחדש. שיטות של גרימת תאים לפלוריפוטנטיות התפתחו משימוש בווקטורים רטרו-ויראליים9, וקטורים lentiviral נסלחים10,11 ושיטות מבוססות טרנספוסון12 כדי לא שילוב וקטורים אדנו-ויראליים13 וקטורים מבוססי וירוססנדאי 14. תכנות מחדש מבוסס רטרו-ויראלי ולנטיוויראלי, אם כי יעיל, כרוך בשילוב של גורמי תכנות מחדש לתוך כרומוזומי המארח, גרימת מוטציות הכנסה אשר יש השפעות בלתי צפויות ב- iPSCs. יתר על כן, תכנות מחדש מבוסס ויראלי מונע יישום תרגום של iPSCs. מערכות מבוססות RNA15 ואספקת חלבונים ישירה16 נחקרו כדי לחסל לחלוטין את הסיכונים הפוטנציאליים הקשורים לשימוש בווירוסים ובהעברות DNA. עם זאת, שיטות אלה הוכיחו לא יעיל.
בשנת 2011, Okita ואח ‘ דיווחו על יעילות משופרת של תכנות מחדש על ידי פלסמידים אפיזומליים מוגברת עם דיכוי TP53 באמצעות shRNA. הם גם החליפו את cMYC ב- LMYC שאינו משתנה (קרצינומה של ריאות תאים קטנים הקשורים ל- MYC) כדי לשפר את הבטיחות של hiPSCs. פלסמידים אפיזומליים אלה מבטאים 5 גורמי תכנות מחדש: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC ו- shRNA עבור TP5317,18. וקטורים אלה נשמרים במיוחד כרומוזומלית ומאבדים מהתאים המתוכנתים מחדש על תרבית רציפה, ובכך הופכים את הקווים ללא טרנסג’נים בתוך 10-15 מעברים. Nucleofection היא צורה מיוחדת של אלקטרופורציה המספקת חומצות גרעין ישירות לתוך הגרעין של תאים מארחים. זוהי שיטה יעילה למסירה של פלסמידים תכנות מחדש לסוגי תאים שונים. פלסמידים אפיזומליים הם חסכוניים ולפצות על העלויות הגבוהות של nucleofection. שיטה זו יעילה ווניתנת לשחזור בתנאים ממוטבים המניבים IPSCs יציבים ממגוון תאים סומטיים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השיטה ליצירת IPSCs מפיברובלסטים המבודדים מרקמת העובר על ידי נוקלאופקט של פלסמידים לתכנות מחדש אפיזומלי. הנה הפרוטוקולים המפורטים לבידוד פיברובלסט מווילי כוריוני עוברי, טיהור פלסמיד, נוקלאופקט, קטיף מושבות מצלחת התכנות מחדש והקמת IPSCs יציבים.
זה חיוני כדי לאשר את נוכחותם של תכונות pluripotency ב- iPSCs שנוצרו לאחרונה. זה כולל הדגמה של גורמים הקשורים pluripotency (למשל, ביטוי פוספטאז אלקליין, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin; מוצג בדרך כלל עם אימונופלואורסצנטיות או ביטוי גנים), זיהוי של שלוש שכבות נבט על ידי בדיקות בידול במבחנה כדי לאמת את פוטנציאל הבידול שלהם, קריוטיפינג כדי לקבוע תוכן כרומוזומלי, הקלדת STR כדי לקבוע זהות עם תאי אב, לאמת אובדן של גנים אקסוגניים, ומחמירים יותר ב- vivo assays כגון היווצרות טרטומה והשלמת טטרפלואיד. כאן אנו מתארים פרוטוקולי אפיון של קריוטיפינג, תאים חיים מכתימים פוספטאז אלקליין, זיהוי של סמנים ביולוגיים הקשורים pluripotency על ידי אימונופלואורסצנטיות, במבחנה הבחנה assays ושיטה כדי להדגים אובדן של גנים אקסוגניים19.
Protocol
Representative Results
Discussion
ייצור של מודלים תאיים יציבים של רקמת עובר חריגה ציטוגנטית יש צורך להנציח פנוטיפ פגום. מסלול IPSC הוא השיטה היעילה ביותר של הכנת תאים לשימור תמידי של תכונות פגומות20.
תאי גזע פלוריפוטנטים (PSC) מציגים תכונות של התחדשות עצמית ובידול לתאים מיוחדים המזכירים עוברים מחשו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תמיכה כספית במחקר הנ”ל ניתנה על ידי האקדמיה להשכלה גבוהה מניפל. אפיון הקו נערך בחלקו במעבדה של M.M. Panicker ב- NCBS. אנו מודים למעבדת האבחון Anand על הסיוע בקריוטיפינג.
Materials
| 0.15% trypsin | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | G Banding |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| 4', 6 diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D8417 | Immunocytochemistry |
| Activin A | Sigma Aldrich | SRP3003 | Differentiation assays |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | AP staining |
| AMAXA Nucleofector II | Lonza | – | Nucleofection |
| AmnioMAX II complete media | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11269016 | Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures |
| Ampicillin | HiMedia | TC021 | Plasmid purification |
| Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11059 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunocytochemistry |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15240096 | Contamination control |
| Anti-E-Cadherin | BD Biosciences | 610181 | Immunocytochemistry |
| Anti-Nanog | BD Biosciences | 560109 | Immunocytochemistry |
| Anti-OCT3/4 | BD Biosciences | 611202 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX17 | BD Biosciences | 561590 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX2 | BD Biosciences | 561469 | Immunocytochemistry |
| Anti-SSEA4 | BD Biosciences | 560073 | Immunocytochemistry |
| Anti-TRA 1-81 | Millipore | MAB4381 | Immunocytochemistry |
| basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] | Sigma Aldrich | F0291 | Pluripotency medium |
| Bone Morphogenetic Factor 4 | Sigma Aldrich | SRP3016 | Differentiation assays |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | Blocking |
| Collagen Human Type IV | BD Biosciences | 354245 | Differentiation assays |
| Collagenase blend | Sigma Aldrich | C8051 | Digestion of foetal chorionic villi |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Differentiation assays |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | Differentiation assays |
| FastDigest EcoR1 | Thermo Scientific | FD0274 | Restriction digestion |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2518 | Differentiation assays |
| Giemsa Stain | HiMedia | S011 | G Banding |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS001 | Fixative for karyotyping |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | Differentiation assays |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Heparin sodium | Sigma Aldrich | H3149 | Differentiation assays |
| Insulin solution human | Sigma Aldrich | I9278 | Differentiation assays |
| Insulin Transferrin Selenite | Sigma Aldrich | I1884 | Differentiation assays |
| KAPA HiFi PCR kit | Kapa Biosystems | KR0368 | OriP, EBNA1 PCR |
| KaryoMAX Colcemid | Thermo Fisher Scientific | 15210040 | Mitotic arrest for karyotyping |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10829018 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Luria Bertani agar | HiMedia | M1151F | Plasmid purification |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Differentiation assays |
| MEM Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Methanol | HiMedia | MB113 | Fixative for karyotyping |
| Myosin ventricular heavy chain α/β | Millipore | MAB1552 | Immunocytochemistry |
| NHDF Nucleofector Kit | Lonza | VAPD-1001 | Nucleofection |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Fixing cells |
| pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F | Addgene | 27077 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | Episomal reprogramming Plasmid |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, | 15070063 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | P1951 | Immunocytochemistry |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature. |
| Plasmid purification Kit- Midi prep | QIAGEN | 12143 | Plasmid purification |
| Potassium Chloride Solution | HiMedia | MB043 | Hypotonic solution for karyotyping |
| QIAamp DNA Blood Kit | Qiagen | 51104 | Genomic DNA isolation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Hepatocyte differentiation medium |
| Sodium Citrate | HiMedia | RM255 | Hypotonic solution for karyotyping |
| Triton X-100 | HiMedia | MB031 | Permeabilisation |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25300054 | Subculture of foetal chorionic villi fibroblasts |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | Preparation of PBST |
| β III tubulin | Sigma Aldrich | T8578 | Immunocytochemistry |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 | Differentiation assays |
References
- Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
- Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
- Biancotti, J. -. C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
- Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
- Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
- Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022 (2015).
- Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
- Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Soldner, F., et al. Parkinson’s Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).
