הדפסה תלת-ממדית של מיקרוקארים הידרוג'ל במבחנה על ידי סילון כוח צמיג-אינרציאלי לסירוגין
Summary
מוצג כאן היא טכניקת הדפסה 3D מתון מונע על ידי כוחות צמיגים-אינרציאליים לסירוגין כדי לאפשר את הבנייה של מיקרוקארים הידרוג’ל. חרירים תוצרת בית מציעים גמישות, ומאפשרים החלפה קלה לחומרים וקטרים שונים. מיקרוקארים מחייבים תא בקוטר של 50-500 מיקרומטר ניתן להשיג ולאסוף עבור culturing נוסף.
Abstract
Microcarriers הם חרוזים עם קוטר של 60-250 מיקרומטר ושטח פנים ספציפי גדול, אשר משמשים בדרך כלל כנשאים עבור תרביות תאים בקנה מידה גדול. טכנולוגיית תרבות המיקרוקרייר הפכה לאחת הטכניקות העיקריות במחקר ציטולוגי והיא נפוצה בתחום התרחבות התאים בקנה מידה גדול. Microcarriers הוכחו גם לשחק תפקיד חשוב יותר ויותר בבניית הנדסת רקמות במבחנה והקרנת תרופות קליניות. השיטות הנוכחיות להכנת מיקרוקריירים כוללות שבבים מיקרופלואידיים והדפסת הזרקת דיו, המסתמכים לעתים קרובות על עיצוב ערוץ זרימה מורכב, ממשק דו-פאזי לא תואם וצורת זרבובית קבועה. שיטות אלה מתמודדות עם האתגרים של עיבוד זרבובית מורכב, שינויי זרבובית לא נוחים, וכוחות שחול מוגזמים כאשר מוחלים על bioink מרובים. במחקר זה, טכניקת הדפסה 3D, הנקראת סילון כוח צמיג-אינרציאלי לסירוגין, הוחלה כדי לאפשר בנייה של מיקרוקארים הידרוג’ל בקוטר של 100-300 מיקרומטר. תאים נזרעו לאחר מכן על מיקרו-מכוניות כדי ליצור מודולים להנדסת רקמות. בהשוואה לשיטות הקיימות, שיטה זו מציעה קוטר קצה זרבובית חינם, החלפת זרבובית גמישה, שליטה חופשית בפרמטרים של הדפסה ותנאי הדפסה קלים למגוון רחב של חומרים ביו-אקטיביים.
Introduction
Microcarriers הם חרוזים עם קוטר של 60-250 מיקרומטר ושטח פנים ספציפי גדול והם משמשים בדרך כלל עבור תרבות בקנה מידה גדול של תאים1,2. המשטח החיצוני שלהם מספק אתרי צמיחה בשפע לתאים, והפנים מספקים מבנה תמיכה להתפשטות מרחבית. המבנה הכדורי מספק גם נוחות בניטור ובקרה של פרמטרים, כולל pH, O2, וריכוז של חומרים מזינים ומטבוליטים. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם bioreactors טנק מעורבב, microcarriers יכול להשיג צפיפות תאים גבוהה יותר בנפח קטן יחסית לעומת תרבויות קונבנציונליות, ובכך לספק דרך חסכונית להשיג תרביות בקנה מידה גדול3. טכנולוגיית תרבות מיקרוקרייר הפכה לאחת הטכניקות העיקריות במחקר ציטולוגי, והתקדמות רבה נעשתה בתחום ההתרחבות בקנה מידה גדול של תאי גזע, הפטוציטים, כונדרוציטים, פיברובלסטים ומבנים אחרים4. הם גם נמצאו כלי רכב משלוח סמים אידיאליים ויחידות מלמטה למעלה, ולכן לוקח על עצמו תפקיד חשוב יותר ויותר בהקרנת תרופות קליניות ותיקון הנדסת רקמות במבחנה5.
כדי לענות על דרישות רכוש מכני בתרחישים שונים, סוגים רבים של חומרים הידרוג’ל פותחו לשימוש בבניית microcarriers6,7,8,9,10,11. הידרוג’לים של חומצה אלגינטית וחומצה היאלורונית (HA) הם שניים מהחומרים המיקרו-קרוריים הנפוצים ביותר בשל תאימותם הביולוגית הטובה ויכולת ההצלבה שלהם12,13. Alginate יכול להיות מקושר בקלות על ידי סידן כלוריד, ואת המאפיינים המכניים שלה ניתן לאפנן על ידי שינוי הזמן חוצה קישור. HA מצומד טיירמין מקושר על ידי צימוד חמצוני של moieties טירמין מזורז על ידי מי חמצן ופרוקסידאז חזרת14. קולגן, בשל המבנה הספירלי הייחודי שלו ורשת סיבים מקושרת, משמש לעתים קרובות כאדג’ובנט להתערבב לתוך microcarriers כדי לקדם עוד יותר את הקובץ המצורף לתאים15,16.
השיטות הנוכחיות להכנת מיקרוקריירים כוללות שבבים מיקרופלואידיים, הדפסת הזרקת דיו ו electrospray17,18,19,20,20,21,22,23. שבבים מיקרופלואידיים הוכחו כמהירים ויעילים בייצור מיקרו-קרניים בגודל אחיד24. עם זאת, טכנולוגיה זו מסתמכת על תכנון וייצור ערוץ זרימה מורכב25. טמפרטורה גבוהה או כוחות שחול מוגזמים במהלך הדפסת הזרקת דיו, כמו גם שדות חשמליים אינטנסיביים בגישת electrospray, עלול להשפיע לרעה על המאפיינים של החומר, במיוחד את הפעילות הביולוגית שלה19. חוץ מזה, כאשר מוחל על ביו-חומרים וקטרים שונים, חרירים מותאמים אישית המשמשים בשיטות אלה לגרום למורכבות עיבוד מוגבלת, עלות גבוהה, וגמישות נמוכה.
כדי לספק שיטה נוחה להכנת מיקרוקרייר, טכניקת הדפסה תלת-ממדית הנקראת סילון כוחות צמיגים-אינרציאליים לסירוגין (AVIFJ) יושמה לבניית מיקרו-מכוניות הידרוג’ל. הטכניקה משתמשת בכוחות הנעה כלפי מטה ובלחץ סטטי שנוצר במהלך רטט אנכי כדי להתגבר על מתח פני השטח של קצה הזרבובית ובכך ליצור טיפות. במקום כוחות חמורים ותנאים תרמיים, עקירות מהירות קטנות פועלות ישירות על הזרבובית במהלך ההדפסה, וגורמות להשפעה מינורית על התכונות הפיזיקוכימיות של הביוינק ומציגות משיכה גדולה לחומרים ביו-אקטיביים. תוך שימוש בשיטת AVIFJ, מיקרוקארים של ביו-חומרים מרובים עם קטרים של 100-300 מיקרומטר נוצרו בהצלחה. חוץ מזה, המיקרו-מכוניות הוכחו עוד יותר כקושרות תאים היטב ומספקות סביבת גדילה מתאימה לתאים דבוקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מספק הוראות להכנת סוגים רבים של מיקרוקארים הידרוג’ל וזריעת תאים לאחר מכן. בהשוואה לשיטות הדפסת שבבים מיקרופלואידיים והזרקת דיו, גישת AVIFJ לבניית מיקרו-מכוניות מציעה גמישות רבה יותר והתאמה ביולוגית. זרבובית עצמאית מאפשרת שימוש במגוון רחב של חרירים קלים, כולל מיקרופיפט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של בייג’ינג (3212007), תוכנית המחקר המדעית של יוזמת אוניברסיטת צינגחואה (20197050024), קרן רוח האביב של אוניברסיטת צינגחואה (20201080760), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (51805294), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2018YFA0703004), ופרויקט 111 (B17026).
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
References
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
- Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Naqvi, S. M., et al. Living cell factories – electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
- Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
- Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
- Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
- Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
- Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
- Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
- Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
- Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
- Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
- Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
- Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
- Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
- Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
- Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
- Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
- Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
- Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
- Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
- Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
- Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
- Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).
