Summary

Longitudinale Nachsorge von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenz-Bildgebung

Published: June 14, 2021
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Summary

Dieses Manuskript beschreibt die intravesikale Verabreichung von uropathogenen Bakterien mit einem Lux-Operon zur Induktion einer Harnwegsinfektion bei Mäusen und die anschließende longitudinale In-vivo-Analyse der Bakterienbelastung mittels Biolumineszenzbildgebung.

Abstract

Harnwegsinfektionen (UTI) gehören zu den häufigsten bakteriellen Infektionen beim Menschen und werden routinemäßig mit empirischen Antibiotika behandelt. Aufgrund der zunehmenden mikrobiellen Resistenz ist die Wirksamkeit der am häufigsten verwendeten Antibiotika jedoch zurückgegangen. Um alternative Behandlungsmöglichkeiten zu finden, besteht ein großer Bedarf an einem besseren Verständnis der HWI-Pathogenese und der Mechanismen, die die UTI-Anfälligkeit bestimmen. Um dies im Tiermodell zu untersuchen, ist ein reproduzierbarer, nicht-invasiver Assay zur Untersuchung des Verlaufs der Harnwegsinfektion unabdingbar.

Der Goldstandard für die Aufzählung der Bakterienbelastung ist seit Jahren die Bestimmung von Colony Forming Units (CFU) für ein bestimmtes Probenvolumen. Diese Technik erfordert postmortale Organhomogenate und serielle Verdünnungen, die die Datenausgabe und Reproduzierbarkeit einschränken. Als Alternative gewinnt die Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) an Popularität, um die Bakterienbelastung zu bestimmen. Die Markierung von Krankheitserregern mit einem Lux-Operon ermöglicht den sensitiven Nachweis und die Quantifizierung auf nicht-invasive Weise und ermöglicht so eine longitudinale Nachsorge. Bisher ist die Einführung von BLI in der Harnwegsinfektionsforschung begrenzt.

Dieses Manuskript beschreibt die praktische Implementierung von BLI in einem Maus-Harnwegsinfektionsmodell. Hier wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Kultivierung von Bakterien, die intravesikale Instillation und die Bildgebung bereitgestellt. Die in vivo Korrelation mit CFU wird untersucht und ein Proof-of-Concept wird durch den Vergleich der Keimbelastung von unbehandelten infizierten Tieren mit antibiotikabehandelten Tieren erbracht. Darüber hinaus werden die Vorteile, Einschränkungen und Überlegungen speziell für die Implementierung von BLI in einem in vivo UTI-Modell diskutiert. Die Implementierung von BLI im UTI-Forschungsfeld wird die Erforschung der Pathogenese von UTI und die Entdeckung neuer Wege zur Prävention und Behandlung von UTI erheblich erleichtern.

Introduction

Harnwegsinfektionen (UTI) gehören zu den häufigsten bakteriellen Infektionen beim Menschen. Fast die Hälfte aller Frauen wird im Laufe ihres Lebens eine symptomatische Harnwegsinfektion erfahren1. Infektionen, die auf die Blase beschränkt sind, können zu Harnwegssymptomen wie Zunahme der Harnfrequenz, Dringlichkeit, Hämaturie, Inkontinenz und Schmerzen führen. Wenn die Infektion in die oberen Harnwege aufsteigt, entwickeln die Patienten pyelonephritis mit Unwohlsein, Fieber, Schüttelfrost und Rückenschmerzen. Darüber hinaus leiden bis zu 20% der Patienten mit Harnwegsinfektionen an wiederkehrenden Infektionen, was zu einer dramatischen Abnahme der Antibiotikaempfindlichkeit führt2,3,4. In den letzten Jahren gab es ein wachsendes Interesse an neuartigen Therapien zur Behandlung und Prävention von rezidivierenden Harnwegsinfektionen. Trotz eines besseren Verständnisses der angeborenen und adaptiven Immunität der unteren Harnwege und der bakteriellen Virulenzfaktoren, die für die Invasion und Kolonisierung notwendig sind, wurden keine radikalen Veränderungen im Behandlungsregime auf die tägliche urologische Praxis übertragen2. Um die Pathogenese und Suszeptibilität von Harnwegsinfektionen in vivozu untersuchen, ist ein reproduzierbarer und nicht-invasiver Assay unerlässlich.

Mehrere tierische UTI-Modelle wurden beschrieben, die von Nematoden bis zu Primaten reichen, aber das murine Modell wird überwiegend verwendet5,6. Dieses Modell besteht aus der transurethralen Katheterisierung von (weiblichen) Mäusen und der anschließenden Instillation einer bakteriellen Suspension, am häufigsten uropathogenen Escherichia coli (UPEC), direkt in das Blasenlumen7. Nach der Impfung wurde die Keimbelastung traditionell durch Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE) quantifiziert. Diese Technik erfordert das Opfern von Tieren, um postmortale Organhomogenate und serielle Verdünnungen zu erhalten, was die Datenausgabe und Reproduzierbarkeit einschränkt. Darüber hinaus ist eine longitudinale Nachsorge der Keimbelastung bei einzelnen Tieren mit dieser Technik nicht möglich.

1995 schlugen Contag etal. die Verwendung von biolumineszenzmarkierten Krankheitserregern zur Überwachung von Krankheitsprozessen beilebendenTieren vor 8,9. Seitdem wurde die Biolumineszenzbildgebung (BLI) auf zahlreiche Infektionsmodelle wie Meningitis, Endokarditis, Osteomyelitis, Haut- und Weichteilinfektionen usw. angewendet.10,11,12. Im murinen UTI-Modell kann eine UPEC-Dehnung mit dem kompletten Lux-Operon (luxCDABE) von Photorhabdus luminescens verwendet werden13. Eine enzymatische Reaktion wird durch die bakterielle Luciferase katalysiert, die von der Oxidation langkettiger Aldehyde abhängig ist, die mit reduziertem Flavinmononukleotid in Gegenwart von Sauerstoff reagieren und das oxidierte Flavin, eine langkettige Fettsäure und Licht12ergeben. Das Lux-Operon kodiert für die Luciferase und andere Enzyme, die für die Synthese der Substrate benötigt werden. Daher emittieren alle metabolisch aktiven Bakterien kontinuierlich blaugrünes (490 nm) Licht, ohne dass die Injektion eines exogenen Substrats erforderlich ist12. Photonen, die von lux-markiertenBakterien emittiert werden, können mit hochempfindlichen, gekühlten CCD-Kameras (Charge-Coupled Device) erfasst werden.

Die Verwendung von biolumineszierenden Bakterien in einem Modell für Harnwegsinfektionen ermöglicht die longitudinale, nicht-invasive Quantifizierung der Bakterienbelastung, wobei die Notwendigkeit entfällt, Tiere zu festen Zeitpunkten während der Nachbeobachtung für die CFU-Bestimmung zu opfern. Trotz der breiten Palette von Möglichkeiten, die Beweise für die Robustheit dieser BLI-Technik in anderen Bereichen und ihre Vorteile gegenüber klassischen Modellen der Harnwegsinfektion sammeln, wurde sie in der HWI-Forschung nicht weit verbreitet. Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung und hebt die Vorteile von BLI für die gesamte zukünftige UTI-Forschung hervor.

Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Gemeinschaftsrates der Europäischen Union durchgeführt und von der Tierethikkommission der KU Leuven genehmigt (P158/2018). 1. Kultivierende Bakterien (angepasst an7,13,14) Präparat Wählen Sie einen lumineszierenden UPEC-Stamm, der den experimentellen Anforderungen am besten entspricht.HINWEIS: Hier wurde da…

Representative Results

In vivo BLI korreliert mit der KBE des Inokulums zum Zeitpunkt der Instillation.Um die Nachweisgrenze von BLI in vivo und die Korrelation mit der KBE des Inokulums zu bewerten, wurden Mäuse mit unterschiedlichen Konzentrationen von UTI89-lux und PBS als Negativkontrolle infiziert. Vor der Instillation wurden nicht infizierte Tiere gescannt, um die Hintergrundlumineszenz zu bestimmen. Nachfolgende Bilder wurden unmittelbar nach der Instillation aufgenommen…

Discussion

Vorteile von BLI gegenüber CFU-Zählungen
Längsschnittdaten
Ein großer Nachteil der traditionellen Methode zur Zählung der KBE zur Quantifizierung der mikrobiellen Belastung ist die Anforderung von postmortalen Organhomogenaten, die nur einen Querschnittsdatenpunkt pro Tier liefern. Umgekehrt ermöglicht BLI eine nicht-invasive Längsschnitt-Nachsorge infizierter Tiere. Die Tiere können 2 bis 3 Mal am Tag abgebildet werden und geben einen detaillierten Einblick in die Kinetik der Infe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Forschungsstiftung – Flandern (FWO Vlaanderen; G0A6113N), der Forschungsrat der KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. und W.E.) und das VIB (an T.V.). W.E. ist leitender klinischer Forscher der Forschungsstiftung – Flandern (FWO Vlaanderen). Die Sorte UTI89-lux war ein großzügiges Geschenk aus dem Labor von Prof. Seed13.

Materials

96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate Corning 3925 for in vitro imaging
Aesculap ISIS Aesculap GT421 hair trimmer, with GT608 cap
Anesthesia vaporizer Harvard apparatus limited N/A https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL Bayer N/A Enrofloxacin
BD Insyte Autoguard 24 GA BD 382912 Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation
C57Bl/6J mice Janvier N/A
Centrifuge 5804R Eppendorf EP022628146
Dropsense 16 Unchained Labs Trinean to measure OD 600nm
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco ThermoFisher Scientific REF 14040-083
Ethanol 70% denaturated 5L VWR international 85825360
Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap Corning 352057
Falcon 50ml cellstart Greiner 227285
Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL Sigma-Aldrich 26203 to ensure slow bacterial instillation of 50 µL
Inoculation loop Roth 6174.1 holder: Art. No. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g Dechra Veterinary products N/A Isoflurane
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer REF 124262 imaging device
Kanamycine solution 50 mg/mL Sigma-Aldrich CAS 25389-94-0
Living Imaging Software PerkinElmer N/A BLI acquisition software, version 4.7.3
Luria Bertani Broth Sigma-Aldrich REF L3022 alternatively can be made
Luria Bertani Broth with agar Sigma-Aldrich REF L2897 alternatively can be made
Petri dish Sterilin 90mm ThermoFisher Scientific 101VR20 to fill with LB agar supplemented with Km
Pyrex Culture flask 250 mL Sigma-Aldrich SLW1141/08-20EA
Slide 200 Trinean Unchained Labs 701-2007 to measure OD 600nm
UTI89-lux N/A N/A Generous gift from Prof. Seed
Vortex VWR international 444-1372

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Luyts, N., Vande Velde, G., Vanneste, M., De Bruyn, H., Janssens, A., Verstraeten, N., Voets, T., Everaerts, W. Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (172), e62614, doi:10.3791/62614 (2021).

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