ضخ الغدة الباروتية الرجعية من خلال قناة ستينسن في الرئيسيات غير البشرية لتسليم الجينات المتجهة
Summary
وقد اقترحت الغدد اللعابية كموقع مستهدف للأنسجة للعلاج الجيني، ولا سيما في مجال التطعيم عن طريق نقل الجينات. نحن نثبت تسليم الجينات في نموذج الرئيسيات غير البشرية باستخدام التسريب السباتي الرجعي.
Abstract
الغدد اللعابية هي هدف الأنسجة جذابة للعلاج الجيني مع نتائج واعدة تؤدي بالفعل إلى التجارب على الإنسان. فهي قادرة بطبيعتها على إفراز البروتينات في مجرى الدم ويمكن الوصول إليها بسهولة، مما يجعلها مواقع أنسجة متفوقة محتملة لإنتاج هرمون بديل أو التطعيم عن طريق نقل الجينات. وتشمل الطرق المقترحة لتسليم الجينات الحقن عبر الجلد والضخ الرجعي من خلال القنوات اللعابية. نحن نبين كيفية إجراء ضخ الغدة اللعابية الرجعية (RSGI) في الرئيسيات غير البشرية. نحن نصف المعالم التشريحية الهامة بما في ذلك تحديد الحليمة الباروتية ، وهي طريقة صدمية لتكتل وختم قناة ستينسن باستخدام أدوات الأسنان الأساسية ، وأنابيب البولي إيثيلين ، وسيانواكريلات ، والمعدل المناسب للتسريب. في حين أن هذه هي الطريقة الأقل صدمة للتسليم ، إلا أن الطريقة لا تزال محدودة بسبب الحجم الذي يمكن تسليمه (<0.5 مل) واحتمال حدوث صدمة في القناة والغدة. نحن نثبت باستخدام التنظير الفلوري أنه يمكن تسليم غرسة بالكامل في الغدة ، ونثبت كذلك من خلال الكيمياء المناعية نقل ناقل نموذجي والتعبير عن الجين المسلم.
Introduction
في حين أن الغدد اللعابية معروفة بإنتاجها للإفرازات من اللعاب ، فقد أدرك الباحثون منذ فترة طويلة قدرتها على إفراز البروتينات مباشرة في مجرى الدم1، مما يجعلها هدفا محتملا للعلاج الجيني للإدارة الجهازية ، مثل الهرمونات البديلة أو إنتاج الأجسام المضادة. في الواقع ، توفر الغدد اللعابية العديد من المزايا على أهداف الأنسجة الأخرى ، مثل القدرة المتأصلة على إنتاج البروتينات للإفراز (نقص عضلات الخاصية) ، والتغليف الثقيل الذي يمكن أن يحد من انتشار النواقل ، والأنسجة المتباينة جيدا التي توفر الاستقرار للناقلات غير المتكاملة. وعلاوة على ذلك، في حالة حدوث حدث سلبي خطير، الغدد اللعابية ليست حاسمة للحياة ويمكن إزالتها جراحيا. في حين لا بديهية على الفور، الغدد السباتية هي أيضا يمكن الوصول إليها بسهولة من الفم من خلال القناة إفراز الرئيسية، القناة ستينسن2.
نظرا لمزايا الأنسجة اللعابية للعلاج الجيني ، هناك اهتمام متزايد باستكشاف هذا الهدف النسيجي. وقد أجريت بالفعل العديد من الدراسات في القوارض, ال, ونماذج الرئيسيات غير البشرية وعلى الأقل تجربة سريرية بشرية واحدة جارية3,4,5. ولمزيد من استكشاف وتطوير فائدة هذا الهدف من الأنسجة لأغراض العلاج الجيني، سيتعين إجراء المزيد من الدراسات غير البشرية على الرئيسيات. تصف هذه الورقة طريقة للوصول إلى الغدد السباتية من خلال قناة ستينسن لتقديم جين متجه للعبور في نموذج الرئيسيات غير البشرية. لإثبات بشكل واضح تسليم غرس وتشريح القناة عند دخولها الغدة ، تم إجراء التنظير الفلوري باستخدام الاتصالات الراديوية. ولإثبات نجاح نقل ناقل، استخدم جين فيروس أدينو المصلي 5 (Ad5) الموجه egfp. Ad5 هو ناقل يوصف جيدا قادرة على تحويل الأنسجة اللعابية. على الرغم من أنه مناعي للغاية للاستخدام السريري النهائي ، فقد تم اختيار ناقل Ad5 لهذه الدراسة التجريبية لضمان النقل الفعال. تقييم إنتاج البروتين الفلوري الأخضر المحسن (EGFP) هو طريقة موصوفة جيدا لإثبات النسخ الناجح والترجمة لجين متجه بعد النقل وتم القيام به هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نصف بروتوكول التسريب إلى الوراء في الغدة السباتية من خلال قناة ستينسن. تقدم المنهجية الموصوفة إرشادات يمكن استخدامها من قبل الباحثين الذين يستكشفون فائدة الأنسجة اللعابية كموقع للعلاج الجيني والتطبيقات الأخرى.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة لضمان نجاح الإجراء. أولا و…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يريد المؤلفون أن يشكروا السيد كاغني جنتري على دعمه السمعي البصري في تصوير الإجراء. نريد أيضا أن نعترف بمركز Hefner VA الطبي للحصول على الدعم الأكاديمي في متابعة هذا المشروع.
Materials
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
