Retrograde parotisklierinfusie via het kanaal van Stensen in een niet-menselijke primaat voor vectored genafgifte
Summary
Speekselklieren zijn voorgesteld als een weefseldoelplaats voor gentherapie, vooral op het gebied van vaccinatie door genoverdracht. We demonstreren genafgifte in een niet-menselijk primatenmodel met behulp van retrograde parotisinfusie.
Abstract
Speekselklieren zijn een aantrekkelijk weefseldoel voor gentherapie met veelbelovende resultaten die al leiden tot menselijke proeven. Ze zijn inherent in staat om eiwitten in de bloedbaan af te scheiden en zijn gemakkelijk toegankelijk, waardoor ze potentieel superieure weefselplaatsen zijn voor vervangingshormoonproductie of vaccinatie door genoverdracht. Voorgestelde methoden voor genafgifte omvatten transcutane injectie en retrograde infusie via speekselkanalen. We demonstreren hoe retrograde speekselklierinfusie (RSGI) moet worden uitgevoerd bij niet-menselijke primaten. We beschrijven de belangrijke anatomische oriëntatiepunten, waaronder de identificatie van de parotis papilla, een atraumatische methode voor het cannuleren en afdichten van Stensen’s Duct met behulp van elementaire tandheelkundige hulpmiddelen, polyethyleenbuizen en cyanoacrylaat, en de juiste infusiesnelheid. Hoewel dit de minst traumatische methode van levering is, wordt de methode nog steeds beperkt door het volume dat kan worden afgeleverd (<0,5 ml) en het potentieel voor trauma aan het kanaal en de klier. We tonen met behulp van fluoroscopie aan dat een infundaat volledig in de klier kan worden afgeleverd en tonen verder aan door immunohistochemie de transductie van een typische vector en expressie van het afgeleverde gen.
Introduction
Hoewel speekselklieren bekend staan om hun exocriene productie van speeksel, hebben onderzoekers al lang hun vermogen erkend om eiwitten rechtstreeks in de bloedbaan af tescheiden 1, waardoor ze een potentieel doelwit zijn voor gentherapie voor systemische toediening, zoals vervangingshormonen of antilichaamproductie. In feite bieden speekselklieren verschillende voordelen ten opzichte van andere weefseldoelen, zoals het inherente vermogen om eiwitten te produceren voor secretie (een eigenschap die spieren missen), zware inkapseling die vectordiffusie kan beperken en goed gedifferentieerd weefsel dat stabiliteit biedt voor niet-integrerende vectoren. Bovendien zijn speekselklieren in het geval van een ernstige bijwerking niet kritiek voor het leven en kunnen ze operatief worden verwijderd. Hoewel niet onmiddellijk intuïtief, zijn parotisklieren ook gemakkelijk toegankelijk vanuit de mond via hun belangrijkste uitscheidingskanaal, Stensen’s Duct2.
Gezien de voordelen van speekselweefsel voor gentherapie, is er steeds meer interesse in het verkennen van dit weefseldoel. Talrijke studies zijn al uitgevoerd in knaagdier-, honden- en niet-menselijke primatenmodellen en ten minste één klinische proef bij mensen is aan de gang3,4,5. Om het nut van dit weefseldoel voor gentherapiedoeleinden verder te onderzoeken en te ontwikkelen, zullen meer niet-menselijke primatenstudies moeten worden uitgevoerd. Dit artikel beschrijft een methode voor toegang tot de parotisklieren via Stensen’s Duct om een vectored gen voor transductie af te leveren in het niet-menselijke primaatmodel. Om de afgifte van het infundaat en de anatomie van het kanaal bij het binnenkomen van de klier zichtbaar aan te tonen, werd fluoroscopie met behulp van radiocontrast uitgevoerd. Om succesvolle transductie van een vector aan te tonen, werd een Adenovirus serotype 5 (Ad5) vectored egfp-gen gebruikt. Ad5 is een goed beschreven vector die speekselweefsel kan transduceren. Hoewel het te immunogeen is voor ultiem klinisch gebruik, werd voor deze demonstratiestudie een Ad5-vector gekozen om efficiënte transductie te garanderen. Het evalueren van Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) productie is een goed beschreven methode om succesvolle transcriptie en translatie van een vectored gen na transductie aan te tonen en werd hier gedaan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een protocol van retrograde infusie in de parotisklier via het kanaal van Stensen. De beschreven methodologie biedt richtlijnen die mogelijk kunnen worden gebruikt door onderzoekers die het nut van speekselweefsel onderzoeken als een site voor gentherapie en andere toepassingen.
Er zijn meerdere kritieke stappen om het succes van de procedure te garanderen. Eerst en vooral moeten alle procedurele stappen voorzichtig worden voltooid. Krachtige versteviging van de mond kan le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de heer Cagney Gentry bedanken voor zijn audiovisuele ondersteuning bij het filmen van de procedure. We willen ook het Hefner VA medisch centrum erkennen voor academische ondersteuning bij het nastreven van dit project.
Materials
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
