벡터 유전자 전달을 위한 비인간 영장류에서 스텐센의 덕트를 통한 역행 파로티드 글랜드 주입
Summary
타액선은 유전자 치료를 위한 조직 표적 사이트로서, 특히 유전자 전달에 의한 예방 접종 영역에서 제안되었다. 역행 마루드 주입을 활용한 비인간 영장류 모델에서 유전자 전달을 시연합니다.
Abstract
침샘은 이미 인체 실험으로 이어지는 유망한 결과를 가진 유전자 치료를 위한 매력적인 조직 표적입니다. 그(것)들은 본질적으로 혈류량으로 단백질을 분비할 수 있고 쉽게 접근할 수 있습니다, 그(것)들을 유전자 전송에 의하여 대체 호르몬 생산 또는 예방 접종을 위한 잠재적으로 우수한 조직 사이트를 만들기. 유전자 전달을 위한 건의한 방법은 타액 덕트를 통해 경피 주입 및 역행 주입을 포함합니다. 우리는 비 인간 영장류에서 역행 타액 선동맥 주입 (RSGI)을 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 parotid 유두의 식별, 기본 치과 도구를 사용하여 스텐슨의 덕트를 수착하고 밀봉하는 외상성 방법, 폴리에틸렌 튜브 및 시아노아크라이레이트, 적절한 주입 속도를 포함한 중요한 해부학 적 랜드 마크를 설명합니다. 이것은 전달의 가장 외상적인 방법이지만, 방법은 여전히 전달 될 수있는 부피 (<0.5 mL)와 덕트와 동맥에 외상의 잠재력에 의해 제한됩니다. 당사는 불소시경검사를 사용하여 인퓨아이 선으로 완전히 전달될 수 있음을 입증하고, 면역히스토케로 전달된 유전자의 전형 및 발현을 더욱 입증한다.
Introduction
타액선은 타액의 외분 생산으로 잘 알려져 있지만, 연구자들은 오랫동안혈류1에직접 단백질을 분비하는 능력을 인식하여 대체 호르몬이나 항체 생산과 같은 전신 투여를 위한 유전자 치료의 잠재적 인 표적이 되었습니다. 실제로, 타액선은 분비(재산 근육 부족), 벡터 확산을 제한할 수 있는 무거운 캡슐화, 비통합 벡터에 대한 안정성을 제공하는 잘 분화된 조직 등 다른 조직 표적에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 또한 심각한 부작용이 발생할 경우 타액선은 생명에 중요하지 않으며 외과적으로 제거 될 수 있습니다. 즉시 직관적이지는 않지만, 파로티드 땀샘은 메인 배설덕트인 스텐센덕트2를통해 입에서 쉽게 접근할 수 있습니다.
유전자 치료를 위한 타액 조직의 장점을 감안할 때, 이 조직 표적을 탐구에 있는 관심이 증가하고 있습니다. 설치류, 개 및 비인간 영장류 모델에서 이미 수많은 연구가 수행되었으며 적어도 하나의 인간 임상 시험이3,4,5로진행중이다. 유전자 치료 목적을 위해이 조직 표적의 유용성을 더 탐구하고 개발하기 위해 더 많은 비 인간 영장류 연구가 수행되어야합니다. 이 논문은 비인간 영장류 모델에서 트랜스포메이션을 위한 벡터 유전자를 전달하기 위해 스텐센덕트를 통해 파로티드 땀샘에 접근하는 방법을 설명합니다. 선으로 들어갈 때 덕트의 내후및 해부학의 전달을 눈에 띄게 입증하기 위해, 방사선 대조를 이용하여 형광술이 수행되었다. 벡터의 성공적인 전도를 입증하기 위해, 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 벡터에그fp 유전자가 사용되었다. Ad5는 타액 조직을 변형시킬 수 있는 잘 기술된 벡터이다. 궁극적인 임상 사용을 위해 너무 면역원성이지만, 효율적인 트랜스듀션을 보장하기 위해 이 데모 연구를 위해 Ad5 벡터를 선택했습니다. 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 생산을 평가하는 것은 변환 다음 벡터 유전자의 성공적인 전사 및 번역을 입증하는 잘 설명 된 방법이며 여기에서 수행되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 스텐슨의 덕트를 통해 parotid 선으로 역행 주입의 프로토콜을 설명합니다. 설명된 방법론은 유전자 치료 및 그밖 응용을 위한 사이트로 타액 조직의 유용성을 탐구하는 연구원에 의해 잠재적으로 이용될 수 있는 지도를 제공합니다.
절차의 성공을 보장하기 위한 여러 가지 중요한 단계가 있습니다. 무엇보다도 모든 절차 단계를 부드럽게 완료해야 합니다. 입의 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 절차 촬영에 자신의 시청각 지원에 대한 씨 Cagney 젠트리에게 감사드립니다. 우리는 또한이 프로젝트를 추구하는 학문적 지원을위한 헤프너 VA 의료 센터를 인정하고 싶습니다.
Materials
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
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