快速、经济、简单地生产无细菌细胞裂解物
Summary
该协议描述了一种快速而简单的方法，使用工程化的 大肠杆菌 菌株生产细菌裂解物以实现无细胞基因表达，并且只需要标准的实验室设备。
Abstract
无细胞基因表达提供了生物学的力量，而没有生物体的并发症。尽管存在许多这样的基因表达系统，但大多数购买和/或需要特殊设备和精细磨练的专业知识才能有效生产。该协议描述了一种生产细菌无细胞裂解物的方法，该裂解物仅使用标准实验室设备并且需要最少的处理， 支持高水平的基因表达。该方法使用大肠杆菌菌株产生不影响生长的内溶素，但在简单的冻融循环后有效地裂解收获的细胞沉淀。唯一需要的进一步处理是短暂的孵育，然后离心以清除细胞碎片的自溶物。动态基因回路可以通过收获前细胞中ClpX蛋白酶的异源表达来实现。缺乏lacZ基因的大肠杆菌菌株可用于使用比色法或荧光读数的高灵敏度，无细胞生物传感应用。整个方案只需要8-9个小时，从接种到完成只需要1-2个小时的动手劳动。通过降低获得无细胞裂解物的成本和时间，该方法应提高各种应用中无细胞基因表达的可负担性。
Introduction
与使用活细胞1，2，3，4相比，无细胞裂解物中的基因表达有几个优点。裂解物可以很容易地进行生物化学修饰，并用于可能对活细胞有害或不可能实现的条件下。基因表达回路不必与宿主生物过程竞争或竞争，测试新的遗传回路就像添加DNA一样简单。由于这些原因，无细胞基因表达已经找到了各种应用，从生物传感器5，6到快速原型合成基因电路7，8到发育中的人造细胞9。大多数无细胞基因表达利用经过高度处理的细胞裂解物，通常需要漫长而复杂的实验方案，专用设备和/或敏感步骤，这可能导致使用者和批次之间的显着差异10，11。
本文描述了一种简单、有效的无细胞裂解物生产方法，该方法需要最少的处理和专业知识（图1A）12。该方法依赖于大肠杆菌细胞，这些细胞被设计为在简单的冻融循环后裂解。细胞从噬菌体λ中表达一种内溶解素，该内溶蛋白会降解细胞壁。随着细胞的生长，这种内溶蛋白保留在细胞质中，与细胞壁隔离。然而，一个简单的冻融循环会破坏细胞质膜，将内溶蛋白释放到周质中，在那里它会降解细胞壁，从而导致快速细胞裂解。该协议只需几个小时的动手工作即可完成，只需要一个冰箱，一个能够30，000×克的离心机（以获得最佳结果;可以使用较低的速度，更小心地不要干扰沉淀），一个涡旋混合器和一个简单的缓冲溶液。功能性裂解物甚至可以通过冷冻干燥细胞并原位再水化来产生 。然而，这种方法产生活性较低的裂解物，可能是由于剩余的细胞碎片。
裂解物对无细胞基因表达具有高度活性，并且可以根据最终用途以各种方式增强。通过使用标准离心浓缩器浓缩裂解物，可以进一步提高蛋白质合成速率。通过添加纯化的GamS蛋白，可以保护线性DNA免于降解。蛋白质降解是振荡等更复杂的电路动力学所必需的，可以通过在产生自洽物的菌株13中共表达ClpX六聚体来实现。最后，通过使用缺乏lacZ的自溶物菌株来启用基于 LacZ的视觉读数。总体而言，该方法可产生高活性的无细胞裂解物，适用于广泛的应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的方案产生用于无细胞基因表达的高活性细菌裂解物。关键是使用携带质粒pAD-LyseR的细胞，其以胞质方式表达lambda噬菌体内溶蛋白。这些细胞被增强以在内膜的通透性下裂解自身，允许内溶蛋白进入细胞壁，该方法通过简单的冻融循环实现。由于细胞有效地裂解自身，因此该产物被称为自溶物。细胞裂解后，仅剩的步骤是孵育和离心以清除细胞碎片的自溶物。
与其?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢Zachary Sun和Richard Murray（加州理工学院）提供了质粒P_araBAD-gamS，并感谢Kaeko Kamei（京都工业大学）提供了高速冷却离心机。这项工作得到了美国国立卫生研究院和ARO MURI计划的资助，并得到了日本文部科学省优秀青年研究人员领先倡议的部分支持。
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
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