Bakteri hücresi içermeyen Lysate'in Hızlı, Uygun Fiyatlı ve Karmaşık Olmayan Üretimi
Summary
Bu protokol, Escherichia coli’nin tasarlanmış bir suşunu kullanarak ve sadece standart laboratuvar ekipmanı gerektiren hücresiz gen ekspresyözü için bakteriyel lisat üretmek için hızlı ve basit bir yöntemi açıklar.
Abstract
Hücresiz gen ekspresyasyonu, canlı bir organizmanın komplikasyonları olmadan biyolojinin gücünü sunar. Bu tür birçok gen ekspresyon sistemi olmasına rağmen, çoğu satın almak için oldukça pahalıdır ve / veya etkili bir şekilde üretmek için özel ekipman ve ince honlanmış uzmanlık gerektirir. Bu protokol, sadece standart laboratuvar ekipmanlarını kullanarak ve minimum işlem gerektiren, yüksek düzeyde gen ekspresyonını destekleyen bakteri hücresiz lisat üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, büyümeyi etkilemeyen, ancak basit bir donma-çözülme döngüsünü takiben hasat edilen bir hücre peletini verimli bir şekilde yukan bir endolysin üreten bir Escherichia coli suşu kullanır. Gerekli olan tek işlem, hücresel kalıntıların otomatik olarak temizlenmesi için kısa bir inkübasyon ve ardından santrifüjlemedir. Dinamik gen devreleri, hasattan önce hücrelerdeki ClpX proteazının heterolog ifadesi ile elde edilebilir. LacZ geni olmayan bir E. coli suşu, kolorimetrik veya floresan bir okuma kullanılarak yüksek hassasiyetli, hücresiz biyosens uygulamaları için kullanılabilir. Tüm protokol, aşılamadan tamamlanmaya kadar sadece 1-2 saatlik uygulamalı çalışma ile 8-9 saat kadar az bir süre gerektirir. Hücre içermeyen lisat elde etmek için maliyeti ve zamanı azaltarak, bu yöntem çeşitli uygulamalar için hücresiz gen ekspresyonunun karşılanabilirliğini artırmalıdır.
Introduction
Hücresiz lisatlarda gen ekspresyoz, canlı hücreler1, 2,3,4kullanma konusunda çeşitliavantajlarasahiptir. Lysates biyokimyasal olarak kolayca değiştirilebilir ve canlı hücrelerde elde edilmesi zararlı veya imkansız olabilecek koşullarda kullanılabilir. Gen ekspresyon devreleri konak biyolojik süreçlerle uğraşmak veya rekabet etmek zorunda değildir ve yeni genetik devreleri test etmek DNA eklemek kadar basittir. Bu nedenlerden dolayı, hücresiz gen ekspresyözü biyosensörlerden5,6’dan hızlı prototipleme sentetik gen devrelerine 7 ,8’den yapay hücreler geliştirmeye kadar çeşitli uygulamalar bulmuş9. Çoğu hücresiz gen ekspresyasyonu, genellikle uzun ve karmaşık protokoller, özel ekipmanlar ve / veya kullanıcılar ve partiler arasında önemli farklılıklara yol açabilecek hassas adımlar gerektiren, yüksek oranda işlenmiş hücresel lysates kullanır10,11.
Bu makalede, minimum işleme ve uzmanlık gerektiren hücresiz lisat üretmek için basit ve verimli bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1A)12. Yöntem, basit bir donma-çözülme döngüsünü takiben iyse için tasarlanmış E. coli hücrelerine dayanır. Hücreler, hücre duvarını bozan faj lambda’dan bir endolysin ifade eder. Hücreler büyüdükçe, bu endolysin hücre duvarından inzit edilen sitoplazmda kalır. Bununla birlikte, basit bir donma-çözülme döngüsü sitoplazmik zarı bozar, endolizi periplazma bırakır, burada hücre duvarını bozar ve hızlı hücre lizisine neden olur. Protokol sadece birkaç saatlik uygulamalı çalışma ile tamamlanabilir ve sadece bir dondurucu, 30.000 × g kapasiteli bir santrifüj (optimum sonuçlar için; peleti rahatsız etmemek için daha düşük hızlar kullanılabilir), bir girdap karıştırıcısı ve basit bir tampon çözeltisi gerektirir. Fonksiyonel lisat, hücrelerin dondurularak kurutılması ve yerinde yeniden sulandırılmasıyla bile üretilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem, muhtemelen kalan hücre kalıntıları nedeniyle daha düşük aktiviteye sahip lysates üretir.
Lysates hücresiz gen ekspresyonu için oldukça aktiftir ve son kullanıma bağlı olarak çeşitli şekillerde geliştirilebilir. Protein sentezi oranı, standart spin konsantratörleri kullanılarak lizat konsantre edilerek daha da arttırılabilir. Doğrusal DNA, saflaştırılmış GamS proteini eklenerek bozulmaya karşı korunabilir. Salınım gibi daha karmaşık devre dinamikleri için gerekli olan protein bozulması, otolisat üreten gerinim13’tebir ClpX heksamerinin birlikte ifade edilmesiyle elde edilebilir. Son olarak, LacZ tabanlı görsel okumalar, lacZolmayan otomatik olarak bir gerinim kullanılarak etkinleştirilir. Genel olarak, bu yöntem çok çeşitli uygulamalar için uygun olan son derece aktif hücresiz lisat üretir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, hücresiz gen ekspresyözü için oldukça aktif bakteriyel lisat verir. Anahtar, lambda faj endolizini sitolizik olarak ifade eden plazmid pAD-LyseR’i taşıyan hücreleri kullanmaktır. Bu hücreler, iç zarın permeabilizasyonu üzerine kendilerini izlendirmek için güçlenir ve endolysin’in hücre duvarına erişmesini sağlar, bu da yöntemin basit bir donma-çözülme döngüsü ile elde ettiği. Hücreler kendilerini etkili bir şekilde uzatır çünkü, ürün otomatik olarak adland?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Zachary Sun ve Richard Murray’e (Kaliforniya Teknoloji Enstitüsü) plazmid P_araBAD-gamS’i sağladıkları için ve Kaeko Kamei’ye (Kyoto Teknoloji Enstitüsü) yüksek hızlı bir soğutma santrifüjü sağladıkları için teşekkür ediyor. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve ARO MURI programından hibelerle desteklendi ve kısmen Mükemmel Genç Araştırmacılar, MEXT, Japonya Lider Girişimi tarafından desteklendi.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free “breadboard”. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
