דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (IPSCs). כדי להשיג אורגנוידים במוח בכמויות גדולות ובאיכות גבוהה, אנו משתמשים ביו-רה-קטרים מיני תוצרת בית.
Abstract
האורגנויד המוחי שמקורו ב- iPSC הוא טכנולוגיה מבטיחה למידול במבחנה של הפתולוגיות של מערכת העצבים והקרנת סמים. טכנולוגיה זו התפתחה לאחרונה. הוא עדיין בחיתוליו ויש לו כמה מגבלות שעדיין לא נפתרו. הפרוטוקולים הנוכחיים אינם מאפשרים להשיג organoids להיות עקבי מספיק לגילוי סמים ומחקרים פרה קליניים. ההתבגרות של organoids יכול לקחת עד שנה, דוחף את החוקרים להשיק תהליכי בידול מרובים בו זמנית. היא מטילה עלויות נוספות עבור המעבדה מבחינת שטח וציוד. בנוסף, אורגנוידים במוח לעתים קרובות יש אזור נמק במרכז, אשר סובל ממחסור בחומרים מזינים וחמצן. לפיכך, רוב הפרוטוקולים הנוכחיים להשתמש במערכת במחזור עבור מדיום תרבות כדי לשפר את התזונה.
בינתיים, אין מערכות דינמיות זולות או bioreactors לטיפוח organoid. מאמר זה מתאר פרוטוקול לייצור אורגנוידים במוח במיני-רה-קטרים ביתיים קומפקטיים וזולים. פרוטוקול זה מאפשר קבלת organoids באיכות גבוהה בכמויות גדולות.
Introduction
מודלים אנושיים נגזר iPSC נמצאים בשימוש נרחב במחקרים של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות1. במהלך העשור האחרון, מודלים של רקמת מוח תלת-ממדית, מה שמכונה organoidsהמוח, השלימו למעשה תרביות עצביות 2D מסורתיות . האורגנוידים מסכמים במידה מסוימת את הארכיטקטורה התת-ממדית של המוח העוברי ומאפשרים מידול מדויק יותר. פרוטוקולים רבים מתפרסמים עבור הדור של organoids המייצגים אזורי מוח שונים: קליפת המוח3,4,5, המוח הקטן6, המוח האמצעי, המוח הקדמי, ההיפותלמוס7,8,9, והיפוקמפוס10. היו דוגמאות רבות לשימוש באורגנוידים כדי לחקור מחלות מערכת העצבים האנושית11. כמו כן, organoids יושמו בתגליות סמים12 ושימש במחקרים של מחלות זיהומיות, כולל SARS-Cov-213,14.
האורגנוידים במוח יכולים להגיע לקוטר של עד כמה מילימטרים. לכן, האזור הפנימי של האורגנויד עלול לסבול מהיפוקסיה או מתת תזונה ובסופו של דבר להפוך לנמק. לכן, פרוטוקולים רבים כוללים bioreactors מיוחדים8, שייקרים, או מערכות microfluidic15. התקנים אלה עשויים לדרוש כמויות גדולות של מדיה יקרה של תרבית תאים. כמו כן, העלות של ציוד כזה היא בדרך כלל גבוהה. כמה bioreactors מורכבים חלקים מכניים רבים שהופכים אותם קשה לעקר לשימוש חוזר.
רוב הפרוטוקולים סובלים “אפקט אצווה”16, אשר מייצר שונות משמעותית בין organoids המתקבלים iPSCs זהה. שונות זו מעכבת בדיקות סמים או מחקרים פרה-קליניים הדורשים אחידות. התשואה הגבוהה של organoids מספיק כדי לבחור organoids בגודל אחיד עשוי לפתור חלקית בעיה זו.
גורם הזמן הוא גם בעיה משמעותית. Matsui ואח ‘ (2018) הראה כי organoids המוח דורשים לפחות שישה חודשים כדי להגיע לבגרות17. Trujillo ואח ‘ (2019) גם הוכיח כי פעילות אלקטרופיזיולוגית התרחשה organoids רק לאחר שישה חודשים של טיפוח18. בשל זמן ההתבגרות האורגנויד הארוך, החוקרים לעתים קרובות להשיק בידול חדש לפני השלמת הקודם. תהליכים מקבילים מרובים של בידול דורשים הוצאות נוספות, ציוד ושטח מעבדה.
לאחרונה פיתחנו מיני bioreactor זה פותר בעיקר את הבעיות שהוזכרו לעיל19. ביו-ריאקטור ביתי זה מורכב מהדבקה נמוכה במיוחד או צלחת פטרי לא מטופלת עם ידית פלסטיק במרכז. ידית פלסטיק זו מונעת צפיפות של organoids ואת conglutination שלהם במרכז צלחת פטרי, אשר נגרמת על ידי סיבוב של שייקר. מאמר זה מתאר כיצד ביו-רקטור מיני זול ופשוט תוצרת בית זה מאפשר לייצר אורגנוידים במוח באיכות גבוהה בכמויות גדולות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כולל שני שלבים מכריעים המאפשרים יצירת אורגנוידים באיכות גבוהה בגודל אחיד. ראשית, האורגנוידים גדלים מפרואידים שהם כמעט זהים במספר התא ובבגרות התא. שנית, הביו-ראקטורים תוצרת בית מספקים לכל אורגנויד סביבה אחידה, שבה האורגנוידים אינם מצטופפים או נשארים זה לזה.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק 075-15-2019-1669 ממשרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית (ניתוח RT-PCR) ועל ידי מענק מס ’19-15-00425 מקרן המדע הרוסית (לכל עבודה אחרת). המחברים מודים גם לפאבל בליצ’קוב על עזרתו בעריכת הווידאו. דמויות בכתב היד נוצרו עם BioRender.com.
Materials
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
- Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
- Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
- Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
- Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
- Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820 (2021).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
- Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790 (2021).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).
