집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성
Summary
여기에서 우리는 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 두뇌 유기체를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 다량의 뇌 오르가노이드와 고품질의 뇌 오르가노이드를 얻기 위해, 우리는 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용합니다.
Abstract
iPSC 유래 뇌 오르가노이드는 신경계 및 약물 검진의 병리를 모델링하는 시험관 내 유망한 기술입니다. 이 기술은 최근에 등장했습니다. 아직 초기 단계에 있으며 아직 해결되지 않은 몇 가지 제한이 있습니다. 현재 프로토콜은 약물 발견 및 전임상 연구를 위해 오르가노이드를 얻는 것이 충분히 일관되지 않습니다. 오르가노이드의 성숙은 1 년까지 걸릴 수 있습니다, 동시에 여러 분화 프로세스를 시작하는 연구원을 밀어. 그것은 공간과 장비의 측면에서 실험실에 대한 추가 비용을 부과한다. 또한, 뇌 오르가노이드는 종종 중앙에 괴사 영역을 가지고, 이는 영양소와 산소 결핍으로 고통. 따라서, 대부분의 현재 프로토콜은 영양을 개선하기 위해 배양 매체에 대한 순환 시스템을 사용합니다.
한편, 오르가노이드 재배를 위한 저렴한 동적 시스템이나 생물 반응기는 없습니다. 이 논문은 컴팩트하고 저렴한 수제 미니 바이오 리액터에서 뇌 오르가노이드를 생산하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 대량으로 고품질 의 오르가노이드를 얻을 수 있습니다.
Introduction
인간 iPSC 유래 모델은 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환1의연구에서 널리 사용된다. 지난 10 년 동안, 3D 뇌 조직 모델, 소위 뇌 오르가노이드, 본질적으로 전통적인 2D 신경 문화를 보완2. 오르가노이드는 배아 뇌의 3D 아키텍처를 어느 정도 재구성하고 보다 정확한 모델링을 허용합니다. 대뇌 피질3,4,5,소뇌6,중뇌, 전뇌, 시상하부7,8,9,해마10: 많은 프로토콜은 다른 뇌 영역을 나타내는 오르가노이드의 생성을 위해 게시된다. 인간 신경계 질환을 연구하기 위해 오르가노이드를 사용하는 여러 가지 예가있었다(11). 또한, 오르가노이드는 약물발견(12)에서 구현되었고 SARS-Cov-213,14를포함한 전염병 연구에 사용되었다.
뇌 오르가노이드는 직경이 최대 몇 밀리미터에 달할 수 있습니다. 따라서 오르가노이드의 내부 영역은 저산소증이나 영양실조로 고생하고 결국 괴사가 될 수 있습니다. 따라서, 많은 프로토콜은 특수 생물 반응기8,셰이커, 또는 미세 유체시스템(15)을포함한다. 이러한 장치는 고가의 세포 배양 매체의 대량을 요구할 수 있다. 또한 이러한 장비의 비용은 일반적으로 높습니다. 일부 생물 반응기는 재사용을 위해 살균하기 어렵게 만드는 많은 기계적 부품으로 구성됩니다.
대부분의 프로토콜은 동일한 iPSC에서 얻은 오르가노이드 간에 상당한 변동성을 생성하는 “배치 효과”16으로인해 어려움을 겪습니다. 이 가변성은 균일성을 요구하는 약물 검사 또는 전임상 연구를 방해합니다. 균일 한 크기의 오르가노이드를 선택할 만큼 충분히 오르가노이드의 높은 수율은 부분적으로이 문제를 해결할 수 있습니다.
시간 계수도 중요한 문제입니다. 마쓰이 외(2018)는 뇌 오르가노이드가 성숙도17에도달하기 위해서는 최소 6개월이 필요하다는 것을 보여주었다. Trujillo 외(2019)는 또한 전기생리활성이 6개월간의 재배 후18일후에만 오르가노이드에서 발생했다는 것을 입증하였다. 긴 오르가노이드 성숙 시간으로 인해 연구자들은 종종 이전 을 완료하기 전에 새로운 차별화를 시작합니다. 차별화의 여러 병렬 프로세스에는 추가 비용, 장비 및 실험실 공간이 필요합니다.
최근에는 19위에 언급된 문제를 주로 해결하는 미니 바이오반응기를개발했습니다. 이 집에서 만든 생물 반응기는 중앙에 플라스틱 노브가있는 초저 접착 또는 처리되지 않은 페트리 접시로 구성되어 있습니다. 이 플라스틱 노브는 셰이커의 회전에 의해 발생하는 페트리 접시의 중심에 오르가노이드의 혼잡과 그들의 응축을 방지합니다. 이 논문은 이 저렴하고 간단한 수제 미니 바이오 리액터가 어떻게 고품질의 뇌 오르가노이드를 대량으로 생성할 수 있는지 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명된 프로토콜에는 균일한 크기의 고품질 오르가노이드생성을 허용하는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 오르가노이드는 세포 수와 세포 성숙도에서 거의 동일한 스페로이드에서 증가합니다. 둘째, 집에서 만든 생물 반응기는 각 오르가노이드가 군중이나 함께 붙어 있지 않는 균일 한 환경을 제공합니다.
세포 의 질과 세포 성숙의 상태는 프로토콜을 수행하는 데 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 러시아 연방 과학 고등 교육부 (RT-PCR 분석)의 보조금 075-15-2019-1669 및 러시아 과학 재단 (다른 모든 작업에 대한)에서 19-15-00425 호를 지원했습니다. 저자는 또한 비디오 편집에 대한 그의 도움에 대한 파벨 벨리코프에게 감사드립니다. 원고의 수치는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.
Materials
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
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