マウス心筋細胞を一貫して単離するための簡単で効果的な方法
Summary
細胞および分子機能実験の心臓病学のゴールドスタンダードは心筋細胞です。この記事では、マウス心筋細胞を単離するための非ランゲンドルフ法への適応について説明します。
Abstract
高品質の心筋細胞を生成する再現性がありながら技術的に単純な方法の必要性は、心臓生物学の研究に不可欠です。心筋細胞に関する細胞および分子機能実験(収縮、電気生理学、カルシウムサイクリングなど)は、疾患のメカニズムを確立するためのゴールドスタンダードです。マウスは機能実験に最適な種であり、記載された技術は特にマウス心筋細胞の単離のためのものです。ランゲンドルフ装置を必要とする以前の方法では、大動脈カニュレーションのために高レベルのトレーニングと精度が必要であり、しばしば虚血を引き起こします。この分野は、シンプルで再現性があり、生理学的データの取得と培養のために生存可能な筋細胞を生成するランゲンドルフフリーの分離方法に移行しています。これらの方法は、大動脈カニュレーションと比較して虚血時間を大幅に短縮し、確実に心筋細胞を得る。ランゲンドルフフリー法への適応には、氷冷透明化溶液による初期灌流、灌流中に安定した針を保証する安定化プラットフォームの使用、および機能測定および培養に使用する心筋細胞を確実に取得するための追加の消化ステップが含まれます。この方法は簡単かつ迅速に実行でき、技術的なスキルはほとんど必要ありません。
Introduction
何十年もの間、心臓生物学の文献に不可欠なアイデアは、分子作用機序です。信頼できる研究を発表するためには、作用機序を確立する必要があります。分子メカニズムを決定するための確立された戦略は、信頼できるデータを得るために高品質の心筋細胞を必要とする単離心筋細胞研究です。作用機序を決定するために心筋細胞に対して行われる細胞および分子実験は、収縮1、電気生理学2、カルシウム(Ca2+)サイクリング3、筋フィラメントCa2+感受性4、細胞骨格5、代謝6、ホルモンの影響7、シグナル伝達分子8、薬物研究9等。マウスは、遺伝子操作の容易さ、サイズが小さく、寿命が比較的短く、低コストなどにより、ほとんどの心臓生物学実験に最適な種になっています10。しかし、高品質のマウス心筋細胞の信頼性の高い単離は、現在の技術では自明ではありません。
ラボは、ほぼ70年間心筋細胞を分離してきました11。心筋細胞を単離する事実上すべての技術は、さまざまな酵素(コラゲナーゼ、プロテアーゼ、トリプシンなど)を介した心臓の消化に依存しています。初期(1950年代から1960年代)には、心臓を取り除き、はるかに小さな断片に切断し、コラゲナーゼ/プロテアーゼ/トリプシン12を含む溶液中でインキュベートするチャンク法が採用されました。1970年代の研究室では、冠状動脈灌流ベースの分離技術(ランゲンドルフ装置を介した酵素による逆行性灌流)を使用して心筋細胞を単離する改善された「ランゲンドルフ」法13を実施しました。この技術は、今日でもこの分野で筋細胞単離の支配的な方法であり、~50年後の14,15,16。最近の研究では、低酸素時間と虚血性損傷を制限するためにin vivoで心臓をカニューレ挿入することに移行し、優れた心筋細胞分離(より良い収量とより高い品質)をもたらします17。最近、これはin vivoで行う、ランゲンドルフフリー心臓灌流18、19、20、21、22に進化した。私たちは、Ackers-Johnsonら18技術に基づいてランゲンドルフフリー心筋細胞分離技術を進化させ、以前の多くの分離技術からさまざまなコンポーネントを採用しました。これらの重要な適応には、氷冷透明化バッファーの注入と、針を安定させるための支持プラットフォームの組み込みが含まれ、心臓の操作を減らします。また、この技術で詳細には、注入されたバッファーの温度制御(37°C)があり、以前に発表されたEDTA灌流が少ないため、in vivo注入から消化までの時間が短縮されました18。心臓の操作を減少させ、したがって穿刺部位のサイズを最小化することによって、冠状動脈の徹底的かつ一定の灌流が得られる。また、二次チャンク法による消化、注入した透明化バッファー中のEDTAの量、およびpHの変更により、この技術を改良しました。ここで説明した技術は、ランゲンドルフ装置を使用する場合と比較して、信頼性が高く、効率的であり、広範なトレーニング/練習を必要としません(表1)。
Protocol
Representative Results
Discussion
当社のランゲンドルフフリー心筋細胞分離技術の主な利点は、ランゲンドルフ装置へのカニューレ挿入を必要としないため、低酸素症と虚血時間を制限することです。心臓の除去、洗浄、吊り下げに数分かかり、筋細胞に虚血性損傷をもたらすことが多い古典的なランゲンドルフ技術の代わりに、私たちの方法には、氷冷透明化溶液を介したin vivo血液透明化が含まれます。氷冷…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所助成金R01 HL114940(Biesiadecki)、R01 AG060542(Ziolo)、およびT32 HL134616(SturgillとSalyer)によってサポートされました。
Materials
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
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