Kardiyolojide hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için altın standart kardiyomiyositlerdir. Bu makalede, fare kardiyomiyositlerini izole etmek için Langendorff dışı tekniğe yapılan uyarlamalar açıklanmaktadır.
Yüksek kaliteli kardiyomiyositler veren tekrarlanabilir ancak teknik olarak basit yöntemlere duyulan ihtiyaç, kalp biyolojisindeki araştırmalar için gereklidir. Kardiyomiyositler üzerinde yapılan hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler (örneğin, kasılma, elektrofizyoloji, kalsiyum döngüsü, vb.) hastalığın mekanizmalarını belirlemek için altın standarttır. Fare, fonksiyonel deneyler için tercih edilen türdür ve açıklanan teknik, özellikle fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu içindir. Langendorff aparatı gerektiren önceki yöntemler, aort kanülasyonu için yüksek düzeyde eğitim ve hassasiyet gerektirir ve sıklıkla iskemi ile sonuçlanır. Alan, basit, tekrarlanabilir ve fizyolojik veri toplama ve kültür için uygulanabilir miyositler veren Langendorff’suz izolasyon yöntemlerine doğru kaymaktadır. Bu yöntemler aort kanülasyonuna kıyasla iskemi süresini büyük ölçüde azaltır ve güvenilir bir şekilde elde edilen kardiyomiyositlerle sonuçlanır. Langendorff’suz yönteme adaptasyonumuz, buz gibi soğuk temizleme çözeltisi ile ilk perfüzyonu, perfüzyon sırasında sabit bir iğne sağlayan stabilize edici bir platformun kullanımını ve fonksiyonel ölçümlerde ve kültürde kullanılmak üzere güvenilir bir şekilde elde edilen kardiyomiyositleri sağlamak için ek sindirim adımlarını içerir. Bu yöntemin uygulanması basit ve hızlıdır ve çok az teknik beceri gerektirir.
On yıllar boyunca, kardiyak biyoloji literatüründe önemli bir fikir, moleküler etki mekanizmasıdır. Güvenilir çalışmaların yayınlanması için etki mekanizması kurulmalıdır. Moleküler mekanizmayı belirlemek için iyi kurulmuş bir strateji, güvenilir verilere ulaşmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gerektiren izole kardiyomiyosit çalışmalarıdır. Kardiyomiyositler üzerinde etki mekanizmasını belirlemek için yapılan hücresel ve moleküler deneyler kasılma1, elektrofizyoloji2, kalsiyum (Ca2+) döngüsü3, miyofilamanCa2+ duyarlılığı4, hücre iskeleti5, metabolizma6, hormonların etkileri7, sinyal molekülleri8, ilaç çalışmaları9 araştırmak için altın standarttır ve saire. Fare, genetik manipülasyonun kolaylığı, küçük boyutu, nispeten kısa ömrü, düşük maliyeti vb.10 nedeniyle çoğu kardiyak biyoloji deneyi için tercih edilen tür haline gelmiştir. Bununla birlikte, yüksek kaliteli fare kardiyomiyositlerinin güvenilir izolasyonu, mevcut tekniklerle önemsiz değildir.
Laboratuvarlar neredeyse 70 yıldır kardiyomiyositleri izole ediyor11. Kardiyomiyositleri izole etmek için hemen hemen tüm teknikler, kalbin çeşitli enzimler (kollajenaz, proteaz, tripsin vb.) Erken dönemlerde (1950’ler-1960’lar), kalbin çıkarılmasını, çok daha küçük parçalara ayrılmasını ve kollajenaz / proteaz / tripsin12 ile çözelti içinde inkübe edilmesini içeren yığın yöntemi kullanılmıştır. 1970’lerde laboratuvarlar, koroner arter perfüzyonuna dayalı bir izolasyon tekniği (Langendorff cihazı aracılığıyla enzim ile retrograd perfüzyon) kullanarak kardiyomiyositleri izole eden iyileştirilmiş “Langendorff” yöntemi13’ü uyguladı; Bu teknik, bugün sahada miyosit izolasyonunun baskın yöntemi olmaya devam etmektedir, ~ 50 yıl sonra14,15,16. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, hipoksi süresini ve iskemik hasarı sınırlamak için kalbin in vivo olarak kanüle edilmesine kaymıştır ve bu da üstün kardiyomiyosit izolasyonları (daha iyi verim ve daha yüksek kalite) ile sonuçlanmıştır17. Son zamanlarda, bu in vivo, Langendorff içermeyen kalp perfüzyonları 18,19,20,21,22 performans göstermeye dönüşmüştür. Langendorff-free kardiyomiyosit izolasyon tekniğini Ackers-Johnson ve ark.18 tekniğine dayanarak geliştirdik ve önceki birçok izolasyon tekniğinden çeşitli bileşenleri uyarladık. Bu önemli uyarlamalar, buz gibi soğuk bir temizleme tamponunun enjeksiyonunu ve iğneyi stabilize etmek için destekleyici bir platformun dahil edilmesini içerir ve bu da kalbin manipülasyonunun azaltılmasına izin verir. Bu teknikte ayrıca ayrıntılı olarak açıklanan, enjekte edilen tamponların sıcaklık kontrolüdür (37 ° C), bu da daha önce yayınlandığı gibi daha az EDTA perfüzyonu nedeniyle in vivo enjeksiyon ve sindirim arasındaki süreyi azaltmıştır18. Kalbin manipülasyonunu azaltarak ve dolayısıyla delinme yeri boyutunu en aza indirerek, koroner arterlerin tam ve sürekli perfüzyonu elde edilir. Ayrıca tekniği ikincil bir yığın yöntemi sindirimi, enjekte edilen temizleme tamponundaki EDTA miktarı ile rafine ettik ve pH’ı değiştirdik. Tarif ettiğimiz teknik daha güvenilir, daha verimlidir ve Langendorff aparatının kullanımına kıyasla kapsamlı bir eğitim/uygulama gerektirmez (Tablo 1).
Langendorff içermeyen kardiyomiyosit izolasyon tekniğimizin temel avantajı, Langendorff cihazına kanülasyon gerektirmeyerek hipoksi ve iskemik zamanı sınırlamasıdır. Kalbin çıkarılması, temizlenmesi ve asılması birkaç dakika süren ve genellikle miyositte iskemik hasara neden olan klasik Langendorff tekniklerine alternatif olarak, yöntemimiz buz gibi soğuk bir temizleme çözeltisi ile kanın in vivo temizlenmesini içerir. Buz gibi soğuk temizleme tamponu, etilendiamintetraasetik as…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) ve T32 HL134616 (Sturgill ve Salyer) tarafından desteklenmiştir.
10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
95% O2 5% CO2 | |||
AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
Pen/Strep | Fisher Sci | ||
Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |