Um ensaio de micropatterning para medir a quiralidade celular
Summary
Apresentamos um protocolo para determinar a quiralidade multicelular in vitro, utilizando a técnica de micropatterning. Este ensaio permite quantificação automática dos vieses esquerdo-direito de vários tipos de células e pode ser usado para fins de triagem.
Abstract
A quiralidade é uma propriedade celular intrínseca, que retrata a assimetria em termos de polarização ao longo do eixo esquerda-direita da célula. Como essa propriedade única atrai cada vez mais atenção devido aos seus importantes papéis no desenvolvimento e na doença, um método padronizado de quantificação para caracterizar a quiralidade celular avançaria na pesquisa e em aplicações potenciais. Neste protocolo, descrevemos um ensaio de caracterização de quiralidade multicelular que utiliza matrizes micropattered de células. Micropatterns celulares são fabricados em lâminas de vidro revestidas de titânio/ouro por impressão de microcontatos. Após a semeadura na direção geométrica definida (por exemplo, em forma de anel), ilhas revestidas de proteínas, as células migram direcionalmente e formam um alinhamento tendencioso em direção ao sentido horário ou ao sentido anti-horário, que pode ser automaticamente analisado e quantificado por um programa MATLAB escrito sob medida. Aqui descrevemos em detalhes a fabricação de substratos micropatterados, semeadura celular, coleta de imagens e análise de dados e mostramos resultados representativos obtidos usando as células NIH/3T3. Este protocolo já foi validado anteriormente em vários estudos publicados e é uma ferramenta eficiente e confiável para estudar a quiralidade celular in vitro.
Introduction
A assimetria esquerda-direita (LR) da célula, também conhecida como mão celular ou quiralidade, descreve a polaridade celular no eixo LR e é reconhecida como uma propriedade fundamental, conservada, biofísica 1,2,3,4,5. A quiralidade celular tem sido observada tanto in vivo quanto in vitro em múltiplas escalas. Achados anteriores revelaram o redemoinho quiral de citesqueleto de actina em células únicas semeadas em ilhas circulares6, migração tendenciosa e alinhamento de células dentro dos limites confinados 7,8,9,10,11, e looping assimétrico do tubo de calor de frango 12.
No nível multicelular, a quiralidade celular pode ser determinada a partir da migração ou alinhamento direcional, rotação celular, dinâmica citoesqueletal e posicionamento de organela celular 7,8,9,10,11,12,13. Estabelecemos um ensaio baseado em micropatterning14 para caracterizar eficientemente o viés quiral das células aderentes 7,8,9,10. Com os micropatterns em forma de anel geometricamente confinando aglomerados celulares, as células exibem coletivamente migração direcional e alinhamento tendencioso. Um programa MATLAB foi desenvolvido para detectar e medir automaticamente o alinhamento celular em imagens de contraste de fase do anel. A direção do alinhamento celular local é quantificada com um ângulo tendencioso, dependendo de seu desvio da direção circunferencial. Após a análise estatística, o padrão do anel das células é designado como vieses no sentido anti-horário (CCW) ou no sentido horário (CW).
Este ensaio tem sido usado para caracterizar a quiralidade de fenótipos de células múltiplas (Tabela 1), e a assimetria LR das células tem sido encontrada como fenótipo específico 7,11,15. Além disso, a interrupção da dinâmica da actina e da morfologia pode resultar em uma reversão do viés quiral 7,8, e o estresse oxidativo pode alterar a quiralidade celular também9. Devido à simplicidade do procedimento e à robustez da abordagem 7,8,9,10, este ensaio de quiralidade 2D fornece uma ferramenta eficiente e confiável para determinar e estudar a quiralidade multicelular in vitro.
O objetivo deste protocolo é demonstrar o uso deste método para caracterizar a quiralidade celular. Este protocolo descreve como fabricar matrizes celulares padronizadas através da técnica de impressão de microcontatos e realizar análises de quiralidade de forma automatizada usando o programa MATLAB.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de padronização em forma de anel descrito aqui fornece uma ferramenta fácil de usar para caracterização quantitativa da quiralidade multicelular, capaz de produzir resultados altamente confiáveis e repetíveis. A geração rápida de microambientes definidos idênticos e análises imparcial permite o processamento automatizado de alto rendimento de grandes tamanhos de amostras. Este protocolo discute a fabricação dos micropatterns do anel, padronização celular e análise automática do alinhamento celu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (OD/NICHD DP2HD083961 e NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan é um Estudioso de Ciências Biomédicas (PEW 00026185), apoiado pela Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang é apoiado pela American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
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