Микроструктурный анализ для измерения хиральности клеток
Summary
Представлен протокол определения многоклеточной хиральности in vitro с использованием методики микроструктурирования. Этот анализ позволяет автоматически количественно определять смещения влево-вправо различных типов клеток и может использоваться для целей скрининга.
Abstract
Хиральность — это внутреннее клеточное свойство, которое изображает асимметрию с точки зрения поляризации вдоль лево-правой оси клетки. Поскольку это уникальное свойство привлекает все большее внимание из-за его важной роли как в развитии, так и в заболевании, стандартизированный метод количественной оценки для характеристики хиральности клеток будет способствовать исследованиям и потенциальным приложениям. В этом протоколе мы описываем многоклеточный анализ характеристик хиральности, который использует микроструктурированные массивы клеток. Сотовые микрошарики изготавливаются на стеклянных слайдах с титановым/золотым покрытием с помощью микроконтактной печати. После посева на геометрически определенных (например, кольцеобразных) островах, покрытых белком, клетки направленно мигрируют и образуют смещенное выравнивание в сторону либо по часовой стрелке, либо против часовой стрелки, которое может быть автоматически проанализировано и количественно определено с помощью специально написанной программы MATLAB. Здесь мы подробно описываем изготовление микроструктурированных субстратов, посев клеток, сбор изображений и анализ данных и показываем репрезентативные результаты, полученные с использованием клеток NIH/3T3. Этот протокол ранее был подтвержден в нескольких опубликованных исследованиях и является эффективным и надежным инструментом для изучения хиральности клеток in vitro.
Introduction
Лево-правая (LR) асимметрия клетки, также известная как клеточная рука или хиральность, описывает полярность клетки в оси LR и признается фундаментальным, сохраненным, биофизическим свойством 1,2,3,4,5. Хиральность клеток наблюдалась как in vivo, так и in vitro в нескольких масштабах. Предыдущие результаты показали хиральное закручивание актинового цитоскелета в одиночных клетках, посеянных на круглых островах6, смещенную миграцию и выравнивание клеток в пределах ограниченных границ 7,8,9,10,11 и асимметричное зацикливание куриной тепловой трубки 12.
На многоклеточном уровне хиральность клеток может быть определена по направленной миграции или выравниванию, клеточному вращению, динамике цитоскелета и позиционированию органелл клеток 7,8,9,10,11,12,13. Мы создали анализ14 на основе микроструктурирования для эффективной характеристики хирального смещения адгезивных клеток 7,8,9,10. С кольцеобразными микроструктурами, геометрически ограничивающими кластеры клеток, клетки в совокупности демонстрируют направленную миграцию и смещенное выравнивание. Была разработана программа MATLAB для автоматического обнаружения и измерения выравнивания клеток на фазоконтрастных изображениях кольца. Направление локального выравнивания ячейки количественно определяется с углом смещения в зависимости от его отклонения от окружного направления. После статистического анализа кольцевая картина клеток обозначается либо как смещения против часовой стрелки (CCW), либо как смещения по часовой стрелке (CW).
Этот анализ был использован для характеристики хиральности нескольких клеточных фенотипов (таблица 1), и было обнаружено, что асимметрия клеток LR является фенотип-специфической 7,11,15. Более того, нарушение динамики и морфологии актина может привести к обращению вспять хирального смещения 7,8, а окислительный стресс может также изменить хиральность клеток9. Из-за простоты процедуры и надежности подхода 7,8,9,10, этот 2D-анализ хиральности обеспечивает эффективный и надежный инструмент для определения и изучения многоклеточной хиральности in vitro.
Целью данного протокола является демонстрация использования данного метода для характеристики хиральности клеток. Этот протокол описывает, как изготавливать узорчатые сотовые массивы с помощью метода микроконтактной печати и проводить анализ хиральности автоматическим способом с помощью программы MATLAB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кольцеобразный анализ паттернов, описанный здесь, обеспечивает простой в использовании инструмент для количественной характеристики многоклеточной хиральности, способный давать высоконадежные и повторяемые результаты. Быстрая генерация идентичных микросред и непредвзятый анализ …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения (OD/NICHD DP2HD083961 и NHBLI R01HL148104). Лео К. Ван является стипендиатом Pew в области биомедицинских наук (PEW 00026185), поддерживаемым благотворительными фондами Pew. Haokang Zhang поддерживается Преддокторской стипендией Американской кардиологической ассоциации (20PRE35210243).
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer’s disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021)
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
