マウスにおける心筋梗塞および心筋虚血再灌流障害の誘発

Summary

ここでは、マイクロマニピュレーションによる左前下行冠動脈の精密結紮により、マウスの心筋梗塞または心筋虚血再灌流障害を誘発できる簡便で再現性のある方法について述べる。

Abstract

急性心筋梗塞は、死亡率の高い一般的な心血管疾患です。心筋再灌流障害は、心臓リフローの有益な効果を打ち消し、二次的な心筋障害を誘発する可能性があります。心筋梗塞と心筋虚血再灌流傷害のシンプルで再現性のあるモデルは、研究者にとって優れたツールです。ここでは、マイクロマニピュレーションによる左前下行冠動脈(LAD)の精密結紮により、心筋梗塞(MI)モデルとMIRIを作成するカスタマイズ可能な方法について説明します。LADの正確で再現性のある結紮位置決めは、心臓損傷に対して一貫した結果を得るのに役立ちます。ST セグメントの変更は、モデルの精度を特定するのに役立ちます。心筋トロポニンT(cTnT)の血清レベルを使用して心筋損傷を評価し、心臓超音波を使用して心筋収縮機能を評価し、エバンスブルー/トリフェニルテトラゾリウムクロリド染色を使用して梗塞のサイズを測定します。一般に、このプロトコルは処置の持続期間を短縮し、制御可能な梗塞のサイズを保障し、そしてマウスの生存を改善する。

Introduction

急性心筋梗塞(AMI)は、世界的に一般的な心血管疾患であり、死亡率が高い¹。技術の進歩により、AMI患者は早期かつ効果的な血行再建術を利用できるようになりました。一部の患者では、これらの治療の後、心筋虚血再灌流障害(MIRI^{)が発生する可能性があります}2。したがって、行動のメカニズムとMI / MIRIを改善する方法を理解することは非常に重要です。マウスは、低コストで育種期間が短く、遺伝子改変が容易であることから、モデルとして広く用いられています³。学者は、動物4,5,6,7,8,9のMIRIとMIIをモデル化するためのさまざまな方法を開発しました。この戦略は研究を促進しますが、採用されている基準と方法が異なるため、研究チーム間で結果の解釈が複雑になります。

マウスでは、心筋梗塞はイソプロテレノール¹⁰、凍結傷害^11,12、または焼灼¹³によって誘導されている。心筋梗塞はイソプロテレノールによって容易に誘発できますが、病態生理学的プロセスは臨床心筋梗塞とは異なります。 凍結傷害誘発性心筋梗塞は一貫性が悪く、左前下行冠動脈(LAD)の周囲に過度の心筋損傷を誘発し、不整脈を誘発しやすい可能性があります。焼灼誘発性心筋梗塞は、心筋梗塞の自然なプロセスとはかなり異なり、灼熱部位の炎症反応はより激しいです。さらに、外科的アプローチには技術的な問題があります。さらに、バルーンブロッキングまたは塞栓術または介入技術による血栓症法を使用して、ミニブタのMIモデルを開発しているラボ¹⁴がいくつかあります。これらの方法はすべて冠動脈閉塞を直接引き起こす可能性がありますが、冠動脈造影装置が必要であり、何よりもマウス冠動脈が細すぎるため、これらの手術は実用的ではありません。MIRIの場合、異なるモデル間の違いは、マスク/マイクロマニピュレーションを使用するかどうかなど、非常に控えめでした^5,6。

ここでは、以前に発表された方法4,5,6,7,8,9,15から採用された、MIおよびMIRIモデルを誘導できる簡単で信頼性の高い方法が説明されています。この方法は、結紮によるLADの直接遮断により、病態生理学的プロセスをシミュレートできます。さらに、結紮を緩和することで、このモデルは再灌流損傷をシミュレートすることもできます。このプロトコルでは、解剖顕微鏡がLADの視覚化に使用されます。そうすれば、研究者はLADを容易に特定することができます。その後、LADの正確な結紮は、再現性のある予測可能な閉塞と心室虚血につながります。また、顕微鏡で観察したLADの色変化に加え、虚血や再灌流の確認にも心電図(ECG)の変化を用いることができます。この戦略により、手術期間が短縮され、外科的合併症のリスクが低くなり、必要な実験用マウスの数が少なくなります。トロポニン-T検査、心臓超音波検査、および塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)染色の方法についても説明します。全体として、このプロトコルはMI/MIRメカニズムの研究や創薬に有用です。

Protocol

動物実験は、華中科技大学(中国・武漢)の動物飼育利用委員会によって承認されています。 注:雄のC57BL / 6Jマウス(8-10週)をモデルとして使用します。マウスは餌と水を自由に入手でき、特定の病原体のない条件で飼育されます。部屋は制御された温度(22°C±2°C)と湿度(45%〜65%)に保たれています。マウスは、同済医科大学(中国、武漢)の動物飼育施設で、この機関が設定し?…

Representative Results

実験ワークフローを 図1Aに示します。研究者は、研究開始時に実験計画に従って時間ノードをスケジュールできます。LADライゲーションの期間は、研究目的によって異なります。MIの場合、研究は再灌流ステップを無視できます。心臓超音波検査は非侵襲的であるため、研究のさまざまな段階で利用できますが、Evans-Blue/TTC染色はマウスを犠牲にした場合にのみ実行でき…

Discussion

近年、臨床および科学研究におけるMIおよびMIRIのモデルの作成が急速に発展しています^20,21。しかし、作用機序やMI/MIRIの改善方法など、解決しなければならない問題がまだいくつか残っています。ここでは、MIおよびMIRIのマウスモデルを確立するための修正プロトコルについて説明する。いくつかの重要なポイントを慎重に検討する必要がありま?…

Materials

0.9 % sodium chloride solution	Kelun Industry Group,China		–
4% paraformaldehyde fixing solution	Servicebio,China	G1101	–
4-0 silk suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	C412	–
8-0 suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	H801	–
Buprenorphine	IsoReag,China	IR-11190	–
Camera	Canon,Japan	EOS 80D	–
Depilatory cream	Veet,French		–
Elecsys Troponin T hs STAT	Roche,Germany		–
Electrochemical luminescence immunoanalyzer	Roche,Germany	Elecsys 2010	–
Evans blue	Sigma,America	E2129	–
Eye scissors	Shanghai Medical Instruments,China	JC2303	–
Haemostatic forceps	Shanghai Medical Instruments,China	J31020	–
High frequency in vivo imaging systems	Visualsonics,Canada	Vevo2100	–
Ibuprofen	PerFeMiKer,China	CLS-12921	–
Intravenous catheter	Introcan,Germany	4254090B	–
Ketamine	Sigma-Aldrich,America	K2753	–
Medical alcohol	Huichang ,China		–
Microneedle holders	Shanghai Medical Instruments,China	WA2040	–
Microscopic shears	Shanghai Medical Instruments,China	WA1040	–
Microsurgical forceps	Shanghai Medical Instruments,China	WA3020	–
Mouse electrocardiograph	Techman,China	BL-420F	–
Needle holders	Shanghai Medical Instruments,China	JC3202	–
operating floor	Chico,China	ZK-HJPT	–
PE-10 tube	Huamei,China		–
Pentobarbital	Merck,America	1030001	–
Rodent Ventilator	Shanghai Alcott Biotech,China	ALC-V8S-P	–
Stereo microscope	Aomei Industry,China	SZM0745-STL3-T3	–
Surgical thermostatic heating pad	Globalebio, China	GE0-20W	–
Triphenyltetrazolium chloride	Servicebio,China	G1017	–
Xylazine	Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China	323004	–