Évaluation fonctionnelle de la kinésine-7 CENP-E dans les spermatocytes à l’aide de l’inhibition in vivo , de l’immunofluorescence et de la cytométrie en flux
Summary
Cet article rapporte une inhibition in vivo de la CENP-E par chirurgie abdominale et injection testiculaire de GSK923295, un modèle précieux pour la division méiotique masculine. En utilisant les tests d’immunofluorescence, de cytométrie en flux et de microscopie électronique à transmission, nous montrons que l’inhibition de la CENP-E entraîne un désalignement chromosomique et une instabilité du génome dans les spermatocytes de souris.
Abstract
Chez les eucaryotes, la méiose est essentielle à la stabilité du génome et à la diversité génétique dans la reproduction sexuée. Les analyses expérimentales des spermatocytes dans les testicules sont essentielles pour les recherches sur l’assemblage du fuseau et la ségrégation chromosomique dans la division méiotique masculine. Le spermatocyte de souris est un modèle idéal pour les études mécanistes de la méiose, cependant, les méthodes efficaces pour les analyses des spermatocytes font défaut. Dans cet article, une méthode pratique et efficace pour l’inhibition in vivo de la kinésine-7 CENP-E dans les spermatocytes de souris est décrite. Une procédure détaillée pour l’injection testiculaire d’un inhibiteur spécifique GSK923295 par chirurgie abdominale chez des souris âgées de 3 semaines est présentée. En outre, une série de protocoles pour la collecte et la fixation des tissus, la coloration à l’hématoxyline-éosine, l’immunofluorescence, la cytométrie en flux et la microscopie électronique à transmission sont décrites ici. Nous présentons ici un modèle d’inhibition in vivo via la chirurgie abdominale et l’injection testiculaire, qui pourrait être une technique puissante pour étudier la méiose masculine. Nous démontrons également que l’inhibition de la CENP-E entraîne un désalignement chromosomique et un arrêt de métaphase dans les spermatocytes primaires au cours de la méiose I. Notre méthode d’inhibition in vivo facilitera les études mécanistes de la méiose, servira de méthode utile pour les modifications génétiques des lignées germinales mâles et mettra en lumière de futures applications cliniques.
Introduction
La méiose est l’un des événements les plus importants, les plus rigides et les plus conservés de l’évolution dans les organismes eucaryotes, et elle est essentielle à la gamétogenèse, à la reproduction sexuée, à l’intégrité du génome et à la diversité génétique 1,2,3. Chez les mammifères, les cellules germinales subissent deux divisions cellulaires successives, la méiose I et II, après un seul cycle de réplication de l’ADN. Contrairement aux chromatides sœurs en mitose, les chromosomes homologues dupliqués s’apparient et se séparent en deux cellules filles au cours de la méiose I 4,5. Dans la méiose II, les chromatides sœurs se séparent et se séparent pour former des gamètes haploïdes sans réplication de l’ADN6. Des erreurs dans l’une ou l’autre des deux divisions méiotiques, y compris les défauts d’assemblage du fuseau et la déségrégation chromosomique, peuvent entraîner la perte de gamètes, des syndromes de stérilité ou d’aneuploïdie 7,8,9.
Des études de plus en plus nombreuses ont montré que les moteurs de la famille des kinésines jouent un rôle crucial dans la régulation de l’alignement et de la ségrégation chromosomiques, de l’assemblage du fuseau, de la cytocinèse et de la progression du cycle cellulaire dans les cellules mitotiques et méiotiques10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (protéine Centromère E) est un moteur kinétochore dirigé vers une extrémité plus nécessaire à la congression des chromosomes, au transport et à l’alignement des chromosomes, et à la régulation du point de contrôle de l’assemblage du fuseau dans la mitose 13,14,15,16,17,18. Au cours de la méiose, l’inhibition de la CENP-E par l’inhibiteur spécifique GSK923295 entraîne l’arrêt du cycle cellulaire, le désalignement chromosomique, la désorganisation du fuseau et l’instabilité du génome dans les cellules spermatogènes19. Les schémas de localisation et la dynamique de la CENP-E aux centromères des spermatocytes en division indiquent que la CENP-E interagit avec les protéines kinétochores pour l’assemblage séquentiel des centromères au cours de la méiose I20,21. Dans les ovocytes, CENP-E est nécessaire pour l’alignement chromosomique et l’achèvement de la méiose I13,22,23. L’injection d’anticorps ou de morpholino de CENP-E entraîne un désalignement des chromosomes, une orientation anormale des kinétochores et un arrêt de la méiose I dans les ovocytes de souris et de drosophile 23. Par rapport aux rôles essentiels de la CENP-E dans la mitose, les fonctions et les mécanismes de la CENP-E dans la méiose restent largement inconnus. Les mécanismes détaillés de la CENP-E dans la conférence chromosomique et la stabilité du génome dans les cellules méiotiques mâles restent à clarifier.
La spermatogenèse est un processus physiologique complexe et de longue durée, impliquant la prolifération séquentielle de la spermatogonie, la méiose et la spermiogenèse. Par conséquent, l’ensemble du processus est extraordinairement difficile à reproduire in vitro chez les mammifères et d’autres espèces24,25. Il est impossible d’induire la différenciation des spermatocytes après le stade pachytène in vitro. Les études sur les divisions méiotiques masculines ont généralement été limitées à des analyses expérimentales de la prophase méiotique précoce25,26. Malgré de nombreux efforts technologiques, y compris la culture à court terme des spermatocytes27,28 et les méthodes de culture d’organes25, il existe peu de méthodes efficaces pour étudier la division méiotique masculine. De plus, la délétion génétique de gènes essentiels entraîne généralement un arrêt du développement et une létalité embryonnaire. Par exemple, les embryons de souris dépourvus de CENP-E ne parviennent pas à s’implanter et ne peuvent pas développer une implantation passée29, ce qui constitue un obstacle dans les études mécanistes de la CENP-E dans la méiose. Pris ensemble, l’établissement d’un système pratique et réalisable pour étudier la division méiotique masculine peut grandement promouvoir le domaine de recherche de la méiose.
L’inhibiteur perméable aux petites cellules est un outil puissant pour étudier les moteurs de kinésine dans la division cellulaire et les processus de développement. L’inhibiteur allostérique, GSK923295, se lie spécifiquement au domaine moteur CENP-E, bloque la libération d’ADP (adénosine diphosphate), et stabilise finalement les interactions entre CENP-E et les microtubules30. Dans cette étude, un modèle murin d’inhibition in vivo est présenté par chirurgie abdominale et injection testiculaire de GSK923295. L’inhibition de la CENP-E entraîne un désalignement chromosomique dans la métaphase I des spermatocytes primaires. De plus, l’inhibition de la CENP-E entraîne l’arrêt méiotique des spermatocytes et la perturbation de la spermatogenèse. Une série de protocoles sont décrits pour les analyses des spermatocytes et peuvent être appliqués pour observer les microtubules du fuseau méiotique, les chromosomes homologues et les organites subcellulaires dans les spermatocytes. Notre méthode d’inhibition in vivo est une méthode efficace pour les études de la division méiotique et de la spermatogenèse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons établi un modèle in vivo d’inhibition CENP-E de testicules de souris en utilisant la chirurgie abdominale et la micro-injection de GSK923295. La chirurgie abdominale et la méthode d’injection testiculaire utilisées dans cette étude présentent les avantages suivants. Tout d’abord, il ne se limite pas à l’âge des souris. Les expérimentateurs peuvent effectuer une injection testiculaire à un stade précoce, par exemple chez des souris âgées de 3 semaines ou moins. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tous les membres du laboratoire de cytosquelette de l’Université médicale du Fujian pour leurs discussions utiles. Nous remercions Jun-Jin Lin du Public Technology Service Center de l’Université médicale du Fujian pour son assistance technique en cytométrie en flux. Nous remercions Ming-Xia Wu et Lin-Ying Zhou du laboratoire de microscopie électronique du Public Technology Service Center de l’Université médicale du Fujian pour leur assistance technique en microscopie électronique. Nous remercions Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke et Jun Song du Centre d’enseignement expérimental des sciences médicales fondamentales de l’Université médicale du Fujian pour leur soutien. Cette étude a été financée par les subventions suivantes: Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro de subvention 82001608), Fondation des sciences naturelles de la province du Fujian, Chine (numéro de subvention 2019J05071), Projet provincial de technologie de la santé du Fujian (numéro de subvention 2018-1-69), Fonds de démarrage pour la recherche scientifique, Université médicale du Fujian (numéro de subvention 2017XQ1001), Projet de financement de démarrage de la recherche scientifique de talents de haut niveau de l’Université médicale du Fujian (numéro de subvention XRCZX2017025) et Projet de recherche de l’éducation et de l’enseignement en ligne des étudiants diplômés en médecine chinoise (numéro de subvention B-YXC20200202-06).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde – aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
References
- Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001 (2016).
- Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
- Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
- Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
- Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
- Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, 2953-2965 (2001).
- Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
- Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
- Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
- Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
- Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
- Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
- Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
- Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
- Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
- Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
- Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
- Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
- Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
- Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
- Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
- Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
- Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
- Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
- Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
- Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
- Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson’s Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
- Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
- Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. 发育生物学. 169 (2), 557-567 (1995).
- Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. 发育生物学. 205 (1), 49-64 (1999).
- Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
- Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
- Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
- Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).
