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Abstract
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生物学

Avaliação funcional da cinesina-7 CENP-E em espermatócitos utilizando inibição in vivo , imunofluorescência e citometria de fluxo

Published: December 28, 2021
doi:
10.3791/63271
, , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital,Affiliated Hospital of Fujian Medical University

Summary

Este artigo relata uma inibição in vivo do CENP-E através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK923295, um modelo valioso para a divisão meiótica masculina. Usando os ensaios de imunofluorescência, citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão, mostramos que a inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico e instabilidade do genoma em espermatócitos de camundongos.

Abstract

Em eucariotos, a meiose é essencial para a estabilidade do genoma e diversidade genética na reprodução sexuada. Análises experimentais de espermatócitos em testículos são críticas para as investigações da montagem do fuso e segregação cromossômica na divisão meiótica masculina. O espermatócito de camundongo é um modelo ideal para estudos mecanísticos da meiose, no entanto, faltam métodos efetivos para a análise de espermatócitos. Neste artigo, um método prático e eficiente para a inibição in vivo da cinesina-7 CENP-E em espermatócitos de camundongos é relatado. Um procedimento detalhado para injeção testicular de um inibidor específico GSK923295 através de cirurgia abdominal em camundongos de 3 semanas de idade é apresentado. Além disso, é descrita uma série de protocolos para coleta e fixação de tecidos, coloração hematoxilina-eosina, imunofluorescência, citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão. Apresentamos aqui um modelo de inibição in vivo via cirurgia abdominal e injeção testicular, que poderia ser uma técnica poderosa para estudar a meiose masculina. Também demonstramos que a inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico e parada metafásica em espermatócitos primários durante a meiose I. Nosso método de inibição in vivo facilitará estudos mecanísticos da meiose, servirá como um método útil para modificações genéticas de linhagens germinativas masculinas e lançará uma luz sobre futuras aplicações clínicas.

Introduction

A meiose é um dos eventos evolutivos conservados mais importantes, altamente rígidos, em organismos eucarióticos, sendo essencial para a gametogênese, reprodução sexuada, integridade do genoma e diversidade genética 1,2,3. Em mamíferos, as células germinativas sofrem duas divisões celulares sucessivas, meiose I e II, após uma única rodada de replicação do DNA. Ao contrário das cromátides irmãs na mitose, cromossomos homólogos duplicados se emparelham e segregam em duas células filhas durante a meiose I 4,5. Na meiose II, cromátides irmãs se separam e segregam para formar gametas haploides sem replicação do DNA6. Erros em qualquer uma das duas divisões meióticas, incluindo defeitos na montagem do fuso e má segregação cromossômica, podem resultar em perda de gametas, esterilidade ou síndromes aneuploidias7,8,9.

Estudos acumulados têm demonstrado que os motores da família das cinesinas desempenham um papel crucial na regulação do alinhamento e segregação cromossômica, montagem do fuso, citocinese e progressão do ciclo celular em células mitóticas e meióticas10,11,12. A cinesina-7 CENP-E (proteína E do centrômero) é um motor de cinetócoro direcionado para a extremidade superior necessário para o congresso cromossômico, transporte e alinhamento cromossômico e regulação do ponto de verificação da montagem do fuso na mitose 13,14,15,16,17,18. Durante a meiose, a inibição do CENP-E pelo GSK923295 inibidor específico leva à parada do ciclo celular, desalinhamento cromossômico, desorganização do fuso e instabilidade do genoma das células espermatogênicas19. Os padrões de localização e a dinâmica do CENP-E nos centrômeros dos espermatócitos em divisão indicam que o CENP-E interage com proteínas cinetocoras para a montagem sequencial de centrômeros durante a meiose I20,21. Nos ovócitos, o CENP-E é necessário para o alinhamento cromossômico e a completação da meiose I13,22,23. A injeção de anticorpos ou morfolinos do CENP-E resulta em cromossomos desalinhados, orientação anormal do cinetócoro e parada da meiose I em ovócitos de camundongos e Drosophila 23. Em comparação com os papéis essenciais do CENP-E na mitose, as funções e mecanismos do CENP-E na meiose permanecem em grande parte desconhecidos. Mecanismos detalhados do CENP-E no congresso cromossômico e na estabilidade do genoma em células meióticas masculinas ainda precisam ser esclarecidos.

A espermatogênese é um processo fisiológico complexo e duradouro, envolvendo proliferação sequencial de espermatogônias, meiose e espermiogênese. Portanto, todo o processo é extraordinariamente difícil de ser reproduzido in vitro em mamíferos e outras espécies24,25. É impossível induzir a diferenciação dos espermatócitos após o estágio de paquiteno in vitro. Estudos sobre divisões meióticas masculinas têm sido geralmente limitados a análises experimentais de prófase meiótica inicial25,26. Apesar de muitos esforços tecnológicos, incluindo cultura de espermatócitos em curto prazo27,28 e métodos de cultura de órgãos25, existem poucos métodos eficazes para estudar a divisão meiótica masculina. Além disso, a deleção genética de genes essenciais geralmente resulta em parada do desenvolvimento e letalidade embrionária. Por exemplo, embriões de camundongos sem CENP-E não conseguem se implantar e não podem desenvolver implantação passada29, o que é um obstáculo nos estudos mecanísticos do CENP-E na meiose. Em conjunto, o estabelecimento de um sistema prático e viável para estudar a divisão meiótica masculina pode promover grandemente o campo de pesquisa da meiose.

O inibidor permeável a pequenas células é uma poderosa ferramenta para estudar motores de cinesina em processos de divisão celular e desenvolvimento. O inibidor alostérico, GSK923295, liga-se especificamente ao domínio motor do CENP-E, bloqueia a liberação de ADP (adenosina difosfato) e, finalmente, estabiliza as interações entre o CENP-E e os microtúbulos30. Neste estudo, um modelo de inibição in vivo em camundongos é apresentado através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK923295. A inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico na metáfase I dos espermatócitos primários. Além disso, a inibição do CENP-E leva à parada meiótica dos espermatócitos e à interrupção da espermatogênese. Uma série de protocolos é descrita para a análise de espermatócitos e pode ser aplicada para observar microtúbulos fusiformes meióticos, cromossomos homólogos e organelas subcelulares em espermatócitos. Nosso método de inibição in vivo é um método eficaz para os estudos da divisão meiótica e espermatogênese.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Fujian Medical University (Protocolo número SYXK 2016-0007). Todos os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes relevantes do Care and Use of Laboratory Animals do National Institutes of Health (NIH publications number 8023, revised 1978). 1. Construção de modelos de camundongos inibidores do CENP-E mediados por GSK923295 Ester…

Representative Results

Construímos com sucesso um modelo in vivo de inibição do CENP-E de testículos de camundongos através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK92329519. Os principais passos técnicos desse método foram mostrados na Figura 1. Após injeção testicular de GSK923295 por 4 dias, os testículos foram colhidos para análises posteriores. No grupo controle, a onda espermatogênica nos túbulos seminíferos era regular e organizada (<strong class="xf…

Discussion

Neste estudo, estabelecemos um modelo in vivo de inibição do CENP-E de testículos de camundongos usando a cirurgia abdominal e microinjeção de GSK923295. A cirurgia abdominal e o método de injeção testicular utilizados neste estudo apresentam as seguintes vantagens. Primeiro, não se limita à idade dos ratos. Os experimentadores podem realizar a injeção testicular em um estágio inicial, por exemplo, em camundongos de 3 semanas de idade ou mais jovens. Em segundo lugar, GSK923295 tem um efeito inibit?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos os membros do Laboratório de Citoesqueleto da Fujian Medical University pelas discussões úteis. Agradecemos a Jun-Jin Lin, do Centro de Serviços de Tecnologia Pública da Fujian Medical University, pela assistência técnica em citometria de fluxo. Agradecemos a Ming-Xia Wu e Lin-Ying Zhou no Laboratório de Microscopia Eletrônica do Centro de Serviços de Tecnologia Pública da Fujian Medical University pelas assistências técnicas em microscopia eletrônica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke, e Jun Song no Centro de Ensino Experimental de Ciências Médicas Básicas da Fujian Medical University por seus apoios. Este estudo foi apoiado pelas seguintes bolsas: Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de bolsa 82001608), Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (número de bolsa 2019J05071), Projeto de Tecnologia de Saúde da Província de Fujian (número de bolsa 2018-1-69), Fundo de Startup para Pesquisa Científica, Universidade Médica de Fujian (número de bolsa 2017XQ1001), projeto de financiamento de start-up de pesquisa científica de talentos de alto nível da Fujian Medical University (número de bolsa XRCZX2017025) e projeto de pesquisa de educação on-line e ensino de estudantes de pós-graduação em medicina chinesa (bolsa número B-YXC20200202-06).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1 ml Syringe Several commercial brands available Sterile.
1.5 mL Centrifuge tube Axygen MCT-150-C
50 mL Centrifuge Tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009164
tubulin rabbit polyclonal antibody Beyotime AF0001 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody Abcam ab267372 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody Sangon Biotech D110022 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody Abcam ab175191 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slides CITOTEST 188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody Beyotime A0423 Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10001060
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 100092690
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto II BD Biosciences FACS Canto II
Bovine Serum Albumin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69003435
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Chloral hydrate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80037516
Citric acid Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 122670
Collagenase Sangon Biotech A004194-0100
Coverslips CITOTEST 10212020C 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPI Beyotime C1006
Dye vat Several commercial brands available 91347802
Eosin Y, alcohol soluble Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71014460
Ether Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009318
Formaldehyde – aqueous solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010018
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
Hematoxylin, anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71020784
ICR mouse Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotome Leica
Leica EM UC-7 ultramicrotome Leica EM UC7
Modfit MFLT32 Verity Software House For analysis of flow cytometry results.
Nail polish Several commercial brands available
Neutral gum Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10004160
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Picric acid Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd J60807
Rheodyne Sangon Biotech F519160-0001 10 μl rheodyne
Sliced paraffin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69019461
Sodium iodate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80117214
Surgical instruments Several commercial brands available For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscope FEI Tecnai G2
Trisodium citrate dihydrate Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 173970
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30188928 Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30189328 Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80096618
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10023418
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References

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Xu, M., Yang, Y., Wei, Y., Zhang, J., Lin, X., Lin, X., Chen, H., She, Z. Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (178), e63271, doi:10.3791/63271 (2021).
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