Stereotaktischer chirurgischer Ansatz zur Mikroinjektion des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks über die Cisterna magna bei Mäusen

Summary

Die stereotaktische Chirurgie zur Ausrichtung auf Gehirnstellen bei Mäusen beinhaltet häufig den Zugang durch die Schädelknochen und wird von Schädel-Landmarken geleitet. Hier skizzieren wir einen alternativen stereotaktischen Ansatz, um den kaudalen Hirnstamm und das obere zervikale Rückenmark über die Cisterna magna anzusprechen, der auf der direkten Visualisierung von Hirnstamm-Landmarken beruht.

Abstract

Stereotaktische Chirurgie, um Gehirnstellen bei Mäusen anzuvisieren, wird häufig von Schädel-Landmarken geleitet. Der Zugang erfolgt dann über Gratlöcher, die durch den Schädel gebohrt werden. Dieser Standardansatz kann für Ziele im kaudalen Hirnstamm und im oberen Gebärmutterhalsstrang aufgrund spezifischer anatomischer Herausforderungen eine Herausforderung darstellen, da diese Stellen von Schädellandmarken entfernt sind, was zu Ungenauigkeiten führt. Hier skizzieren wir einen alternativen stereotaktischen Ansatz über die Cisterna magna, der verwendet wurde, um diskrete Regionen von Interesse im kaudalen Hirnstamm und in der oberen Halsschnur anzusprechen. Die Cisterna magna erstreckt sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas (d.h. dem zweiten Wirbelknochen), ist mit Zerebrospinalflüssigkeit gefüllt und wird von Dura mater bedeckt. Dieser Ansatz bietet einen reproduzierbaren Zugang zu ausgewählten Strukturen des zentralen Nervensystems (ZNS), die aufgrund anatomischer Barrieren sonst schwer zu erreichen sind. Darüber hinaus ermöglicht es die direkte Visualisierung von Hirnstamm-Landmarken in unmittelbarer Nähe zu den Zielstellen, wodurch die Genauigkeit bei der Abgabe kleiner Injektionsvolumina an begrenzte Regionen von Interesse im kaudalen Hirnstamm und in der oberen Halsschnur erhöht wird. Schließlich bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, das Kleinhirn zu vermeiden, was für motorische und sensomotorische Studien wichtig sein kann.

Introduction

Die stereotaktische Standardchirurgie zur gezielten Gehirnstelle bei^{Mäusen 1} beinhaltet häufig die Fixierung des Schädels mit einem Satz Ohrstangen und einem Mundbalken. Die Koordinaten werden dann auf der Grundlage der Referenzatlanten^2,3 und der Schädellandmarken geschätzt, nämlich Bregma (der Punkt, an dem die Nähte der Frontal- und Parietalknochen zusammenkommen) oder Lambda (der Punkt^, an dem die Nähte der Parietal- und Hinterhauptsknochen zusammenkommen; Abbildung 1A,B). Durch ein Gratloch in den Schädel oberhalb des geschätzten Ziels kann dann die Zielregion erreicht werden, entweder für die Lieferung von Mikroinjektionen oder Instrumenten mit Kanülen oder optischen Fasern. Aufgrund von Variationen in der Anatomie dieser Nähte und Fehlern in der Lokalisation von Bregma oder Lambda ^4,5 variiert die Position der Nullpunkte in Bezug auf das Gehirn von Tier zu Tier. Während kleine Fehler beim Targeting, die sich aus dieser Variabilität ergeben, für große oder nahe gelegene Ziele kein Problem darstellen, sind ihre Auswirkungen für kleinere Interessengebiete, die von den Nullpunkten in den anteroposterioren oder dorsoventralen Ebenen entfernt sind, und / oder bei der Untersuchung von Tieren unterschiedlicher Größe aufgrund von Alter, Belastung und / oder Geschlecht größer. Es gibt mehrere zusätzliche Herausforderungen, die für die Medulla oblongata und die obere Halsschnur einzigartig sind. Erstens sind kleine Änderungen der anteroposterioren Koordinaten aufgrund der Position und Form des Kleinhirns mit signifikanten Änderungen der dorsoventralen Koordinaten relativ zur Dura verbunden (Abbildung 1Bi)^2,6,7. Zweitens ist die obere Halsschnur nicht im Schädel^{enthalten 2}. Drittens macht die schräge Position des Hinterhauptbeins und der darüber liegenden Schicht der Nackenmuskulatur² den stereotaktischen Standardansatz für Strukturen, die sich in der Nähe des Übergangs zwischen Hirnstamm und Rückenmark befinden, noch schwieriger (Abbildung 1Bi). Schließlich sind viele Ziele, die im kaudalen Hirnstamm und in der Halsschnur von Interesse sind, klein², was präzise und reproduzierbare Injektionen erfordert ^8,9.

Ein alternativer Ansatz durch die Cisterna magna umgeht diese Probleme. Die Cisterna magna ist ein großer Raum, der sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas erstreckt (Abbildung 1A, d.h. der zweite Wirbelknochen)¹⁰. Es ist mit Zerebrospinalflüssigkeit gefüllt und mit Dura mater¹⁰ bedeckt. Dieser Raum zwischen dem Hinterhauptbein und dem Atlas öffnet sich, wenn der Kopf anteroflexiert wird. Es kann erreicht werden, indem man zwischen den darüber liegenden paarigen Bäuchen des Musculus longus capitis navigiert und die dorsale Oberfläche des kaudalen Hirnstamms freilegt. Interessante Regionen können dann basierend auf den Landmarken dieser Regionen selbst ins Visier genommen werden, wenn sie sich in der Nähe der dorsalen Oberfläche befinden. oder durch die Verwendung des Obex, des Punktes, an dem sich der zentrale Kanal in den IV-Ventrikel öffnet, als Nullpunkt für Koordinaten, um tiefere Strukturen zu erreichen. Dieser Ansatz wurde erfolgreich bei einer Vielzahl von Arten eingesetzt, darunter die Ratte¹¹, Katze¹², Maus^8,9 und der nichtmenschliche Primat¹³, um auf die ventrale Atmungsgruppe, die medulläre mediale retikuläre Formation, den Kern des Einzeltraktes^, die Arealpostrema oder den hypoglossalen Kern abzuzielen. Dieser Ansatz wird jedoch nicht häufig verwendet, da er Kenntnisse der Anatomie, ein spezialisiertes Toolkit und fortgeschrittenere chirurgische Fähigkeiten im Vergleich zum stereotaktischen Standardansatz erfordert.

Hier beschreiben wir einen schrittweisen chirurgischen Ansatz, um den Hirnstamm und das obere Halsband über die Zisterne magna zu erreichen, Orientierungspunkte zu visualisieren, den Nullpunkt zu setzen (Abbildung 2) und die Zielkoordinaten für die stereotaktische Abgabe von Mikroinjektionen in die diskreten Hirnstamm- und Rückenmarksregionen von Interesse zu schätzen und zu optimieren (Abbildung 3). Anschließend besprechen wir die Vor- und Nachteile dieses Ansatzes.

Protocol

Der Autor erklärt, dass das Protokoll den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee am Beth Israel Deaconess Medical Center folgt. 1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten und stereotaktischem Rahmen HINWEIS: Die Operation wird unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die Sterilität wird mit der sterilen Spitzentechnik aufrechterhalten. Installieren Sie den stereotaktischen Arm mit einer Mikropipette oder Spri…

Representative Results

Der Cisterna-Magna-Ansatz ermöglicht es, kaudale Hirnstamm- und obere Halsschnurstrukturen anzusprechen, die sonst über stereotaktische Standardansätze schwer zu erreichen sind oder zu inkonsistentem Targeting neigen. Die Operation, um die Cisterna magna zu erreichen, erfordert Schnitte der Haut, eine dünne Schicht des Trapezmuskels und die Öffnung der Dura mater und wird daher von Mäusen gut vertragen. Es ist besonders effizient und weniger invasiv, wenn es auf mehrere (längs verteilte oder bilaterale) S…

Discussion

Die stereotaktische Standardchirurgie stützt sich häufig auf Schädel-Landmarken, um die Koordinaten der Zielstellen im ZNS¹ zu berechnen. Die Zielstandorte werden dann über Gratlöcher erreicht, die durch den Schädel^{gebohrt werden 1}. Diese Methode ist nicht ideal für den kaudalen Hirnstamm, da sich die Zielstellen in der anteroposterioren und dorsoventralen Ebene² entfernt von den Schädellandmarken befinden und da die Anatomie des Sch…

Materials

Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window