Abordaje quirúrgico estereotáxico para microinyectar el tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la Cisterna Magna en ratones
Summary
La cirugía estereotáxica para atacar los sitios cerebrales en ratones comúnmente implica el acceso a través de los huesos del cráneo y es guiada por puntos de referencia del cráneo. Aquí describimos un enfoque estereotáxico alternativo para apuntar al tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la cisterna magna que se basa en la visualización directa de los puntos de referencia del tronco encefálico.
Abstract
La cirugía estereotáxica para atacar los sitios cerebrales en ratones es comúnmente guiada por puntos de referencia del cráneo. El acceso se obtiene a través de agujeros de rebaba perforados a través del cráneo. Este enfoque estándar puede ser un desafío para los objetivos en el tronco encefálico caudal y la médula cervical superior debido a desafíos anatómicos específicos, ya que estos sitios están alejados de los puntos de referencia del cráneo, lo que lleva a la imprecisión. Aquí describimos un enfoque estereotáxico alternativo a través de la cisterna magna que se ha utilizado para apuntar a regiones discretas de interés en el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. La cisterna magna se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas (es decir, el segundo hueso vertebral), está llena de líquido cefalorraquídeo y está cubierta por duramadre. Este enfoque proporciona una ruta de acceso reproducible a estructuras seleccionadas del sistema nervioso central (SNC) que de otro modo serían difíciles de alcanzar debido a las barreras anatómicas. Además, permite la visualización directa de puntos de referencia del tronco encefálico muy cerca de los sitios objetivo, lo que aumenta la precisión al administrar pequeños volúmenes de inyección a regiones restringidas de interés en el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. Finalmente, este enfoque brinda la oportunidad de evitar el cerebelo, que puede ser importante para los estudios motores y sensoriomotores.
Introduction
La cirugía estereotáxica estándar para atacar los sitios cerebrales en ratones1 comúnmente implica la fijación del cráneo utilizando un conjunto de barras para los oídos y una barra bucal. Las coordenadas se estiman entonces en función de los atlas de referencia 2,3 y los puntos de referencia del cráneo, a saber, bregma (el punto donde se unen las suturas de los huesos frontal y parietal) o lambda (el punto donde se unen las suturas de los huesos parietal y occipital; Figura 1A,B). A través de un orificio de rebaba en el cráneo por encima del objetivo estimado, se puede llegar a la región objetivo, ya sea para la entrega de microinyecciones o instrumentación con cánulas o fibras ópticas. Debido a la variación en la anatomía de estas suturas y errores en la localización de bregma o lambda 4,5, la posición de los puntos cero en relación con el cerebro varía de un animal a otro. Si bien los pequeños errores en la focalización, que resultan de esta variabilidad, no son un problema para objetivos grandes o cercanos, su impacto es mayor para áreas de interés más pequeñas que están alejadas de los puntos cero en los planos anteroposterior o dorsoventral y / o cuando se estudian animales de tamaño variable debido a la edad, la tensión y / o el sexo. Hay varios desafíos adicionales que son únicos para la médula oblonga y el cordón cervical superior. En primer lugar, pequeños cambios en las coordenadas anteroposteriores se asocian con cambios significativos en las coordenadas dorsoventrales en relación con la duramadre, debido a la posición y forma del cerebelo (Figura 1Bi)2,6,7. En segundo lugar, el cordón cervical superior no está contenido dentro del cráneo2. En tercer lugar, la posición inclinada del hueso occipital y la capa suprayacente de los músculos del cuello2 hace que el enfoque estereotáxico estándar sea aún más desafiante para las estructuras ubicadas cerca de la transición entre el tronco encefálico y la médula espinal (Figura 1Bi). Finalmente, muchas dianas de interés en el tronco encefálico caudal y la médula cervical son pequeñas2, requiriendo inyecciones precisas y reproducibles 8,9.
Un enfoque alternativo a través de la cisterna magna elude estos problemas. La cisterna magna es un gran espacio que se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas (Figura 1A, es decir, el segundo hueso vertebral)10. Está lleno de líquido cefalorraquídeo y cubierto por la duramadre10. Este espacio entre el hueso occipital y el atlas se abre al anteroflexionar la cabeza. Se puede acceder navegando entre los vientres pareados suprayacentes del músculo longus capitis, exponiendo la superficie dorsal del tronco encefálico caudal. Las regiones de interés pueden ser atacadas en función de los puntos de referencia de estas regiones si se encuentran cerca de la superficie dorsal; o mediante el uso del obex, el punto donde el canal central se abre en el ventrículo IV, como un punto cero para que las coordenadas alcancen estructuras más profundas. Este enfoque se ha utilizado con éxito en una variedad de especies, incluidas la rata11, el gato12, el ratón 8,9 y el primate no humano13 para atacar el grupo respiratorio ventral, la formación reticular medial medular, el núcleo del tracto solitario, el área postrema o el núcleo hipogloso. Sin embargo, este enfoque no se utiliza ampliamente, ya que requiere conocimientos de anatomía, un conjunto de herramientas especializado y habilidades quirúrgicas más avanzadas en comparación con el enfoque estereotáxico estándar.
Aquí describimos un enfoque quirúrgico paso a paso para llegar al tronco encefálico y la médula cervical superior a través de la cisterna magna, visualizar puntos de referencia, establecer el punto cero (Figura 2) y estimar y optimizar las coordenadas objetivo para la entrega estereotáxica de microinyecciones en las regiones discretas del tronco encefálico y la médula espinal de interés (Figura 3). A continuación, discutimos las ventajas y desventajas relacionadas con este enfoque.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cirugía estereotáxica estándar comúnmente se basa en puntos de referencia del cráneo para calcular las coordenadas de los sitios objetivo en el SNC1. Luego se accede a los sitios objetivo a través de orificios de rebaba que se perforan a través del cráneo1. Este método no es ideal para el tronco encefálico caudal, ya que los sitios objetivo se encuentran distantes de los puntos de referencia del cráneo en los planos anteroposterior y dorsoventral<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por R01 NS079623, P01 HL149630 y P01 HL095491.
Materials
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
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