新生儿鼠心在朗根多夫制剂中的应用改良技术
Summary
本方案描述了新生儿鼠心脏的体 外 旋插管和逆行灌注。 使用解剖显微镜和钝化的小针头的两人策略允许可靠的插管。纵向收缩张力的量化是使用连接到左心室顶点的力传感器实现的。
Abstract
自一个多世纪前Oskar Langendorff开发 以来，使用离体 逆行灌注心脏长期以来一直是缺血再灌注研究的基石。 尽管该技术在过去25年中已应用于小鼠，但其在该物种中的使用仅限于成年动物。开发一种成功的方法以始终如一地对新生儿鼠主动脉进行插管，将允许在遗传可改变和低成本物种的心脏发育的关键时期对孤立的逆行灌注心脏进行系统研究。对朗根多夫制剂的修饰能够在新生儿鼠心脏中进行插管和再灌注，同时最大限度地减少缺血时间。 优化需要两人技术，以允许使用解剖显微镜和改良的市售针头成功插管新生小鼠主动脉。 使用这种方法将在3分钟内可靠地建立逆行灌注。由于新生儿小鼠心脏和心室腔大小的脆弱性阻止了使用球囊产生的脑室内压力的直接测量，因此有必要使用通过缝合线连接到左心室顶点的力传感器来量化纵向收缩张力。这种方法使研究人员能够成功地建立一种孤立的恒流逆行灌注新生儿鼠心脏制剂，从而能够以 离体 方式研究发育性心脏生物学。重要的是，该模型将成为研究新生儿心脏缺血再灌注的生理和药理反应的有力工具。
Introduction
一个多世纪以来，离体心脏制剂一直是生理学、病理生理学和药物学研究的主要内容。源于19世纪60年代Elias Cyon的工作，Oskar Langendorff将分离的青蛙模型用于逆行灌注，加压主动脉根部以提供带氧灌注的冠状动脉流动1。利用他的适应，朗根多夫能够证明冠状动脉循环与机械功能2之间的相关性。离体逆行灌注心脏，后来同名地被称为朗根多夫技术，仍然是生理学研究的基石，利用其简单性在没有潜在混杂物的情况下有力地研究了孤立的心脏。Langendorff制剂已被进一步修改，以允许心脏弹出（所谓的“工作心脏”）并允许灌注物再循环3。然而，感兴趣的主要生理终点保持不变。这些终点包括收缩功能、电传导、心脏代谢和冠状动脉阻力的测量 4。
为了评估他最初的青蛙心脏准备中的心脏功能，Langendorff使用连接在心脏顶点和力传感器之间的缝合线测量了纵轴心室收缩产生的张力。5 等距收缩以这种方式量化，在没有心室充盈的情况下将基础张力施加到心脏上。该方法的改进导致 通过 左心房将充满液体的球囊放入左心室，以评估等值宫收缩期间的心肌表现6。为了评估心律和心率，可以在心脏的两极上放置表面导线，以使研究人员能够记录心电图。然而，鉴于强制性去神经支配，相对心动过缓是可以预期的。外在起搏可能有助于克服这一点并消除实验1之间的心率变异性。另一个结果测量，心肌代谢，可以通过测量冠状动脉灌注物和流出物中的氧和代谢底物含量并计算它们之间的差异来评估7。冠状动脉流出物中的乳酸定量有助于表征厌氧代谢期，如缺氧、低灌注、缺血再灌注或代谢紊乱所示 7.
Langendorff的原创工作使研究体外哺乳动物心脏成为可能，以猫为主要受试者5。对孤立大鼠心脏的评估在1900年代中期随着霍华德·摩根（Howard Morgan）的普及而流行，他在1967年详细介绍了“工作心脏”大鼠模型5。小鼠的使用仅在25年前开始，由于技术复杂性，组织脆弱性和相对较小的鼠心脏尺寸。尽管存在与小鼠研究相关的挑战，但遗传操作的较低成本和易用性增加了这种小鼠离体制剂的吸引力和需求。不幸的是，该技术的应用仅限于成年动物，直到最近，4周龄的幼年小鼠才成为用于离体研究的最年轻的受试者8，9。虽然与成年小鼠相比，幼年小鼠“相对不成熟”，但它们作为发育生物学研究对象的效用有限，因为它们基本上已经从出生母亲那里断奶，很快就会开始青春期10。青春期发生在心肌底物利用从葡萄糖和乳酸盐到脂肪酸11的产后过渡之后。因此，关于新生儿心脏代谢变化的大多数信息历来来自较大物种（如兔子和豚鼠11）的离体工作。
事实上，存在朗根多夫准备的替代方法。这些包括缺乏整个器官功能数据和背景的 体外 实验，或 体内 研究。这在技术上可能具有挑战性，并且由于混淆变量而变得复杂，例如必需麻醉剂的心血管和呼吸系统效应，神经体液输入的影响，核心温度的后果，动物的营养状况以及底物可用性12，13。由于朗根多夫方法允许在没有这种混杂物的情况下以更可控的方式以离 体 方式研究分离灌注心脏，因此它一直并将继续被认为是一种强大的研究工具。因此，这里介绍的技术为研究人员提供了一种用于新生儿鼠心脏体 外 研究的实验方法，并限制了再灌注的时间。
鉴于心肌成熟期间发生的广泛的生化、生理和解剖转变，在发育期间检查心脏是一个重要的考虑因素。从厌氧代谢到氧化磷酸化的转变，底物利用的变化以及从细胞增殖到肥厚的进展是未成熟心脏中独特发生的动态过程11，14。心脏发育的另一个关键方面是，在必要时期遇到的压力源可能会在新生儿心脏中产生更高的反应，并改变未来在成年期对侮辱的易感性15。尽管先前的工作已经利用新生大鼠，羔羊和兔子来研究朗根多夫灌注的新生儿心脏，但鉴于该物种对发育生物学研究的重要性，允许小鼠使用的进步是必要的16。为了满足这一需求，最近建立了第一个使用10天大动物的小鼠Langendorff灌注新生儿心脏模型6。这里介绍的是一种能够成功进行主动脉插管并建立孤立的新生儿鼠心脏逆行灌注的方法。这种方法可用于药理学、缺血再灌注或专注于整个器官功能的代谢研究，或者可用于心肌细胞的分离。
Protocol
Representative Results
Discussion
本工作描述了分离的新生儿小鼠心脏中成功的主动脉插管和逆行灌注。重要的是，它使研究人员能够克服年轻鼠龄和小心脏尺寸先前提出的障碍8。虽然在设计上并不复杂，但这种方法确实需要相当程度的技术技能。即使是技术最熟练的研究者，也不可避免地会面临挑战的关键步骤将是主动脉插管和将套管固定到位。新生儿插管困难不仅仅是由于主动脉腔体积小。升主动脉（主动…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH/NINDS R01NS112706 （R.L.）
Materials
| Rodent Langendorff Apparatus | Radnoti | 130102EZ | |
| 24 G catheter | BD | 381511 | |
| 26 G needle on 1 mL syringe combo | BD | 309597 | |
| 26 G steel needle | BD | 305111 | |
| 5-0 Silk Suture | Ethicon | S1173 | |
| Bio Amp | ADInstruments | FE135 | |
| Bio Cable | ADInstruments | MLA1515 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| Circulating heating water Bath | Haake | DC10 | |
| curved iris scissor | Medline | MDS10033Z | |
| dissecting microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| find spring scissors | Kent | INS600127 | |
| Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Heparin | Sagent | 400-01 | |
| High pressure tubing | Edwards Lifesciences | 50P184 | |
| iris dressing forceps | Kent | INS650915-4 | |
| Jeweler-style curved fine forceps | Miltex | 17-307-MLTX | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911-25G | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Roller Pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| straight dissecting scissors | Kent | INS600393-G | |
| Temporary cardiac pacing wire | Ethicon | TPW30 | |
| Wide Range Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/A |
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