ランゲンドルフ調製における新生児マウス心臓の使用のための修正技術
Summary
本プロトコールは、大動脈カニュール化および 元インビボ 新生児マウス心臓の逆行性灌流を記載する。 解剖顕微鏡と鈍い小さなゲージ針を使用した2人戦略により、信頼性の高いカニューレが可能になります。縦方向の収縮張力の定量化は、左心室の頂点に接続された力伝達器を用いて達成される。
Abstract
エクスビボ逆行性灌流心臓の使用は、1世紀以上前にオスカー・ランゲンドルフによって開発されて以来、長い間虚血再灌流研究の礎石となってきました。 この技術は過去25年間にわたってマウスに適用されてきたが、この種におけるその使用は成体動物に限られていた。新生児マウス大動脈を一貫してカニューレ化する成功した方法の開発は、遺伝的に改変可能で低コストの種における心臓発達の重要な時期に単離された逆行性灌流心臓の系統的研究を可能にするであろう。ランゲンドルフ調製物の改変は、虚血時間を最小限に抑えながら、新生児マウス心臓におけるカニューレおよび再灌流の確立を可能にする。 最適化には、解剖顕微鏡および改変された市販の針を用いた新生児マウス大動脈のカニューレを成功裏に可能にするために、2人技術が必要である。 このアプローチの使用は、3分以内に逆行性灌流を確実に確立する。新生児マウスの心臓および心室腔サイズの脆弱性は、バルーンを使用して発生する脳室内圧の直接測定を妨げるので、縦方向の収縮緊張を定量化するために、左心室の頂点に縫合糸によって接続された力トランスデューサの使用が必要である。この方法により、研究者は単離された定流量逆行性灌流新生マウス心臓製剤を首尾よく確立することができ、発生心臓生物学をエクスビボ方式で研究することを可能にする。重要なことに、このモデルは、新生児の心臓における虚血再灌流に対する生理学的および薬理学的応答を調査するための強力なツールとなるであろう。
Introduction
生体外 心臓製剤は、1世紀以上にわたり、生理学的、病態生理学的、および薬理学的研究の定番となってきた。1860年代のElias Cyonの研究に端を発するオスカー・ランゲンドルフは、単離されたカエルモデルを逆行性灌流に適応させ、大動脈根を加圧して酸素化灌流液1で冠状動脈の流れを提供しました。ランゲンドルフは、彼の適応を用いて、冠状動脈循環と機械的機能2との間の相関関係を実証することができた。後にランゲンドルフ法と呼ばれる 元生体 逆行灌流心臓は、生理学的研究の礎石であり続けており、その単純さを利用して、潜在的な交絡因子が存在しない状態で孤立した心臓を強力に研究しています。ランゲンドルフ調製物は、心臓が排出され(いわゆる「働く心臓」)、灌流液が再循環することを可能にするようにさらに修正された3。しかし、関心のある主要な生理学的エンドポイントは変わっていません。このようなエンドポイントには、収縮機能、電気伝導、心臓代謝、および冠状動脈抵抗の尺度が含まれる4。
彼の最初のカエルの心臓製剤における心機能を評価するために、ランゲンドルフは、心臓の頂点と力のトランスデューサとの間に接続された縫合糸を使用して、縦軸における心室収縮によって生じる張力を測定した。5ア イソメトリック収縮は、心室充填の非存在下で心臓に基礎張力を加えてこのようにして定量化した。アプローチの改良は、等体積収縮中の心筋性能を評価するために、左心房 を介して 左心室に液体充填バルーンを配置することにつながった6。心臓のリズムと心拍数を評価するために、表面リード線を心臓の両極に配置して、治験責任医師が心電図を記録できるようにします。しかし、義務的な脱神経を考えると、相対的な徐脈が期待できる。外因性ペーシングは、これを克服し、実験1間の心拍変動を排除するのに役立ち得る。別の転帰尺度は、心筋代謝、冠状動脈灌流液および廃液中の酸素および代謝基質含有量を測定し、それらの差を計算することによって評価することができる7。冠状動脈流出液中の乳酸塩定量は、低酸素、低灌流、虚血再灌流、または代謝摂動に見られるように、嫌気性代謝の期間を特徴付けるのに役立ちます7。
ランゲンドルフの独創的な研究は、ネコを主な主題として用いた、生体外哺乳類の心臓の研究を可能にした5。孤立したラット心臓の評価は、1967年に「働く心臓」ラットモデルを詳述したハワード・モーガンとともに1900年代半ばに人気を博した5。マウスの使用は、技術的な複雑さ、組織の脆弱性、および比較的小さなマウスの心臓サイズのために、わずか25年前に始まった。マウス研究に関連する課題にもかかわらず、遺伝子操作の低コストおよび容易さは、そのようなマウスのエクスビボ調製物の魅力および需要を増加させている。残念なことに、この技術の適用は成体動物に限定されており、ごく最近まで8,9まで、生後4週間の幼いマウスがex-vivo研究に利用された最年少の被験者でした。幼体マウスは成体と比較して「比較的未熟」であるが、発生生物学研究の被験者としての有用性は、概して出生ダムから離乳しており、まもなく思春期が始まるため、制限されている10。思春期は、グルコースおよび乳酸から脂肪酸への心筋基質利用の出生後の移行をはるかに超えて起こる11。したがって、新生児の心臓における代謝変化に関するほとんどの情報は、歴史的にウサギやモルモットなどのより大きな種におけるエクスビボ作業の結果である11。
実際、ランゲンドルフ調製物に対する代替アプローチが存在する。これらには、臓器全体の機能データおよび文脈を欠いているインビトロ実験、またはインビボ研究が含まれる。これは、必要な麻酔薬の心血管および呼吸効果、神経体液性入力の影響、深部温度の結果、動物の栄養状態、および基質の利用可能性などの交絡変数によって技術的に困難で複雑になり得る12,13。ランゲンドルフのアプローチは、そのような交絡因子の不在下で、より制御された方法で、単離灌流された心臓をエクスビボで研究することを可能にするので、それは強力な治験ツールと考えられてきました。したがって、ここで提示された技術は、新生児マウス心臓のエクスビボ研究のための実験的アプローチを研究者に与え、再灌流までの時間を制限する。
発達期間中の心臓の調査は、心筋成熟期に起こる広範囲の生化学的、生理学的、および解剖学的移行を考えると、重要な考慮事項である。嫌気性代謝から酸化的リン酸化への移行、基質利用の変化、および細胞増殖から肥大への進行は、未熟な心臓において一意に起こる動的プロセスである11、14。発達中の心臓のもう一つの重要な側面は、必要な期間に遭遇するストレッサーが新生児の心臓により高い反応を生み出し、成人期の侮辱に対する将来の感受性を変える可能性があることです15。これまでの研究では、ランゲンドルフ灌流型新生児心臓を研究するために新生児のラット、子羊、ウサギを利用してきたが、発生生物学研究におけるこの種の重要性を考えると、マウスの使用を許可する進歩が必要である16。このニーズに対処するために、10日齢の動物を用いた最初のマウスランゲンドルフ灌流新生児心臓モデルが最近確立されました6。ここで提示されるのは、成功した大動脈カニューレーションを可能にし、単離された新生児マウス心臓の逆行性灌流を確立する方法である。このアプローチは、全器官機能に焦点を当てた薬理学、虚血再灌流、または代謝研究に利用され得るか、または心筋細胞の単離に適合させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究は、単離された新生児マウス心臓における成功した大動脈カニューレーションおよび逆行性灌流について記述する。重要なことに、それは研究者が若いマウスの年齢と小さな心臓サイズが以前に提示した障壁を克服することを可能にします 8.設計は複雑ではありませんが、このアプローチにはかなりの技術的スキルが必要です。最も技術的に熟練した研究者でさえも?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)
Materials
| Rodent Langendorff Apparatus | Radnoti | 130102EZ | |
| 24 G catheter | BD | 381511 | |
| 26 G needle on 1 mL syringe combo | BD | 309597 | |
| 26 G steel needle | BD | 305111 | |
| 5-0 Silk Suture | Ethicon | S1173 | |
| Bio Amp | ADInstruments | FE135 | |
| Bio Cable | ADInstruments | MLA1515 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| Circulating heating water Bath | Haake | DC10 | |
| curved iris scissor | Medline | MDS10033Z | |
| dissecting microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| find spring scissors | Kent | INS600127 | |
| Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Heparin | Sagent | 400-01 | |
| High pressure tubing | Edwards Lifesciences | 50P184 | |
| iris dressing forceps | Kent | INS650915-4 | |
| Jeweler-style curved fine forceps | Miltex | 17-307-MLTX | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911-25G | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Roller Pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| straight dissecting scissors | Kent | INS600393-G | |
| Temporary cardiac pacing wire | Ethicon | TPW30 | |
| Wide Range Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/A |
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