בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית
Summary
פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה ומהירה של culturing שמרים ואת התבנית Aspergillus fumigatus מקבוצות גדולות של דגימות קרקע תוך 7 ימים בלבד. ניתן לשנות את השיטות בקלות כך שיתאימו למגוון של מדיות דגירה וטמפרטורות לפי הצורך לניסויים.
Abstract
אדמה מארחת כמות מדהימה של חיים מיקרוביאליים, כאשר כל גרם מכיל עד מיליארדי תאים חיידקיים, ארכאיים ופטרייתיים. פטריות רב-תאיות כגון עובשים ופטריות חד-תאיות, המוגדרות באופן רחב כשמרים, ממלאות תפקידים חיוניים במערכות האקולוגיות של הקרקע כמפרקים של חומר אורגני ומקורות מזון עבור שוכני קרקע אחרים. מגוון המינים הפטרייתיים בקרקע תלוי במגוון רחב של גורמים אקלימיים כגון גשמים וטמפרטורה, כמו גם תכונות הקרקע כולל חומר אורגני, pH ולחות. היעדר דגימה סביבתית מספקת, במיוחד באזורים באסיה, אפריקה, דרום אמריקה ומרכז אמריקה, מעכב את אפיון קהילות פטריות הקרקע ואת גילוים של מינים חדשים.
אפיינו קהילות פטרייתיות קרקע בתשע מדינות על פני שש יבשות באמצעות כ-4,000 דגימות קרקע ופרוטוקול שפותח במעבדה לבידוד שמרים ועובשים. פרוטוקול זה מתחיל בהעשרה סלקטיבית נפרדת לשמרים ולעובש הרלוונטי מבחינה רפואית Aspergillus fumigatus, במדיה נוזלית תוך עיכוב צמיחת חיידקים. המושבות המתקבלות מועברות לאחר מכן למדיה מוצקה ומעובדות עוד יותר כדי להשיג תרביות טהורות, ולאחר מכן אפיון גנטי במורד הזרם. זהות מיני השמרים נקבעת באמצעות ריצוף של אזור הספייסר המתועתק הפנימי שלהם (ITS) של צביר הגנים RNA ריבוזומלי גרעיני, בעוד שמבנה האוכלוסייה הגלובלי של A. fumigatus נחקר באמצעות ניתוח סמנים מיקרו-לוויניים.
הפרוטוקול יושם בהצלחה כדי לבודד ולאפיין אוכלוסיות של שמרי קרקע ו-A. fumigatus בקמרון, קנדה, סין, קוסטה ריקה, איסלנד, פרו, ניו זילנד וערב הסעודית. ממצאים אלה חשפו תובנות נחוצות על דפוסים גלובליים במגוון השמרים בקרקע, כמו גם על מבנה האוכלוסייה הגלובלית ופרופילי עמידות אנטי פטרייתיים של A. fumigatus. מאמר זה מציג את השיטה של בידוד הן שמרים והן A. fumigatus מדגימות קרקע בינלאומיות.
Introduction
פטריות במערכות אקולוגיות של הקרקע ממלאות תפקידים חיוניים בפירוק חומר אורגני, מחזור חומרי מזון ודישון קרקע1. הן גישות שאינן תלויות בתרבות (כלומר, ריצוף בתפוקה גבוהה) והן גישות תלויות תרבות נמצאות בשימוש נרחב בחקר פטריות אדמה 2,3. בעוד שכמות הנתונים הגדולה שנוצרת על ידי ריצוף metabarcode בתפוקה גבוהה שימושית להבהרת דפוסים בקנה מידה רחב במבנה הקהילה ובמגוון, הגישה התלויה בתרבות יכולה לספק מידע משלים ביותר על המבנים הטקסונומיים והפונקציונאליים של קהילות פטרייתיות, כמו גם פרופילים ספציפיים יותר של אורגניזמים בודדים באמצעות גיוון במורד הזרם וניתוחים פונקציונליים בשל הזמינות של תרבויות פטרייתיות טהורות.
למרות שלעתים רחוקות הם עולים על אלפי תאים לגרם אדמה, שמרים, המוגדרים באופן רחב כפטריות חד-תאיות, הם מתפרקים חיוניים ומקורות מזון עבור שוכני קרקע אחריםבני 4,5. למעשה, שמרים עשויים להיות פטריות הקרקע השולטות בביוספרות קרות כמויבשת אנטארקטיקה 6,7. אדמה היא גם מאגר ראשוני של שמרים רלוונטיים מבחינה רפואית הגורמים לזיהומים אופורטוניסטיים חמורים בבני אדם וביונקים אחרים8. למרות הדמיון המורפולוגי, מיני השמרים מגוונים מבחינה פילוגנטית ומופיעים בקרב פטריות נימה בשתי פילות עיקריות, Ascomycota ו-Basidiomycota, בתוך ממלכת הפטריות9. לשמרים אין חתימת דנ”א מגדירה בגן הברקוד הפטרייתי, אזור הספייסר המתומלל הפנימי (ITS) של אשכול הגנים RNA ריבוזומלי גרעיני10, מה שהופך אותם לבלתי ניתנים להבחנה מפטריות אחרות בחקירות מטא-גנומיקה ובכך מחייבים שימוש בשיטות תלויות תרבית לבידוד מיני שמרים.
הפרוטוקול שלהלן יושם כדי לאפיין קהילות שמרי קרקע של תשע מדינות ולזהות מגמות ודפוסים עולמיים במגוון שמרי הקרקע 9,11,12. גישות מטא-גנומיקה נמצאות בשימוש מוגבל כאשר חוקרים קבוצות ממוקדות של אורגניזמים כגון שמרים 2,3. בשל המגוון הפילוגנטי שלהם, לא ניתן להבחין בין שמרים לפטריות אחרות על סמך רצף דנ”א בלבד. לפיכך, חקר אוכלוסיות שמרים דורש המשך שימוש בבידוד תלוי תרבית. עם זאת, התרבות היא לעתים קרובות הרבה יותר זמן רב ודורשת יותר כוח אדם כדי לבצע את הניסויים. לכן, הפרוטוקול עבר אופטימיזציה וייעול לעיבוד מהיר יותר עם כוח אדם מוגבל. היתרון העיקרי של התרבות הוא שמיני השמרים שזוהו הם שמרים חיים ולא כאלה מתים, ולכן הם נוטים יותר להיות שוכני קרקע אמיתיים ולא תאים חולפים הנמצאים בקרקעות. ההערכה היא שכ-40% מהדנ”א הפטרייתי בקרקע הם מזהמים מסביבות אחרות, חוץ-תאיות, או מגיעים מתאים שאינם שלמים עוד, מה שגורם לגישות ריצוף בתפוקה גבוהה להערכת יתר של עושר פטריות בשיעור של עד 55%13. בידוד תלוי תרבית יכול לאשר בקלות את זהות מיני השמרים עם היתרון הנוסף של הבטחת תרבית טהורה לשימוש בניתוחים במורד הזרם. ואכן, תרביות טהורות של 44 מיני שמרים חדשים זוהו באמצעות פרוטוקול בידוד קרקע זה שאיפשר שימוש במגוון שיטות כדי לחקור את תכונותיהם הטקסונומיות והתפקודיות בפירוט14.
הפרוטוקול שלהלן יכול לשמש גם לבידוד תבניות הקיימות בקרקע, כגון A. fumigatus. אספרגילוס פומיגטוס (Aspergillus fumigatus) הוא עובש תרמופילי וספרופיטי בעל תפוצה גלובלית רחבה בקרקע15. הוא בודד מסביבות קליניות ולא קליניות רבות. דגימה לא קלינית כוללת בדרך כלל אוויר, פסולת אורגנית (קומפוסט, אבק מסור, פסולת נורות צבעונים) ואדמה (קרקע חקלאית, גינה וקרקע טבעית)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus הוא פתוגן אופורטוניסטי אנושי הגורם למגוון זיהומים המכונים באופן קולקטיבי אספרגילוזיס, המשפיעים על למעלה מ -8 מיליון אנשים ברחבי העולם16,20. כ -300,000 אנשים ברחבי העולם סובלים מאספרגילוזיס פולשנית, שהיא הצורה החמורה ביותר של אספרגילוזיס16. בהתאם לגורמים כגון אוכלוסיית המטופלים, אתר ההדבקה והיעילות של טיפול אנטי פטרייתי, שיעור התמותה יכול להיות גבוה עד 90%. במהלך העשורים האחרונים, ההתנגדות לטיפולים אנטי פטרייתיים גדלה, ודרשה מאמצי מעקב עולמיים באוכלוסיות קליניות וסביבתיות כאחד כדי לעקוב אחר גנוטיפים של עמידות אלה 21,22,23. בהתחשב ביכולתו לגדול בטמפרטורות כלפי מעלה של 50 מעלות צלזיוס, ניתן לנצל טמפרטורה זו כדי לבחור עבור A. fumigatus מבודד מהאדמה בשיטות התלויות בתרבית. מבודדי אספרגילוס פומיגטוס הם בדרך כלל גנוטיפיים בתשעה לוקוסים פולימורפיים מאוד של טנדם קצר (STR), שהוכחו כבעלי כוח מפלה גבוה בין זנים24. ניתן להשוות את הגנוטיפים האלה של STR לאוכלוסיות אחרות שנסקרו בעבר כדי לעקוב אחר התפשטות הגנוטיפים של A. fumigatus, כולל גנים של עמידות לתרופות, ברחבי העולם.
להלן נתאר פרוטוקול לבידוד מהיר של שמרים ו- A. fumigatus מדגימות קרקע באופן התלוי בתרבית. בהתאם לכמות הקרקע המתקבלת לכל דגימה, ניתן לחלוק את דגימות הקרקע בין שני הפרוטוקולים. בהשוואה לשיטות דומות המבודדות שמרים ו– A. fumigatus מהאדמה, פרוטוקול זה משתמש בפי 10 פחות אדמה לכל מבודד המתקבל. מחקרים המנסים לבודד את A. fumigatus מהקרקע דורשים בין 1 ל-2 גרם אדמה לכל מבודד, בעוד שפרוטוקול זה דורש רק 0.1-0.2 גרם קרקע 18,19,25. פרוטוקול זה משתמש בפלסטיק ובמיכלים קטנים יותר המאפשרים את תכנון התפוקה הגבוהה שלו. לכן, ניתן לעבד מספר גדול יותר של דגימות תוך שימוש בפחות מקום לציוד כגון אינקובטורים ותופי רולר. דגימות קרקע יכולות להיות מעובדות במלואן כדי לקבל מבודדים תוך 7 ימים בלבד. פרוטוקול זה הותאם כדי לאפשר עיבוד של עד 150-200 דגימות ביום לאדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שפותח לבידוד שמרים ו- A. fumigatus מהאדמה הוא שיטה מהירה ויעילה לעיבוד קרקע בתפוקה גבוהה ובידוד פטרייתי. הפרוטוקול דורש רק כמות קטנה של אדמה (0.1-0.2 גרם) לכל דגימה, מה שמאפשר לדגום יותר אתרים במאמץ דומה. זמן ההסבה המהיר מבטיח שניתן יהיה להשיג תוצאות תוך פרק זמן קצר ומאפשר זמן לפתרון ב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה (מענק מס’ ALLRP 570780-2021) ואוניברסיטת מקמאסטר.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
References
- Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
- Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
- Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
- Yurkov, A. M. Yeasts of the soil – obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
- Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
- Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
- Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
- Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. . The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).
- Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
- Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
- Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
- Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
- Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
- Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
- Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
- Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
- Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
- Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
- Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
- Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
- de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
- Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
- Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
- Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. 遗传学. 111 (4), 715-734 (1985).
- Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
- Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
- De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
- Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
- Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
- Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
- Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
- Wang, H. -. C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).
