Isolamento de Leveduras culturais e moldes de solos para investigar estrutura populacional fúngica
Summary
Este protocolo é um método eficaz e rápido de cultivo de leveduras e o molde Aspergillus fumigatus de grandes conjuntos de amostras de solo em apenas 7 dias. Os métodos podem ser facilmente modificados para acomodar uma gama de mídias de incubação e temperaturas conforme necessário para experimentos.
Abstract
O solo é hospedeiro de uma quantidade incrível de vida microbiana, com cada grama contendo até bilhões de células bacterianas, arqueais e fúngicas. Fungos multicelulares, como moldes e fungos unicelulares, amplamente definidos como leveduras, cumprem papéis essenciais nos ecossistemas do solo como decomposição de material orgânico e como fontes de alimento para outros moradores do solo. A diversidade de espécies fúngicas no solo depende de uma infinidade de fatores climáticos, como chuvas e temperatura, bem como propriedades do solo, incluindo matéria orgânica, pH e umidade. A falta de amostragem ambiental adequada, especialmente em regiões da Ásia, África, América do Sul e América Central, dificulta a caracterização das comunidades fúngicas do solo e a descoberta de novas espécies.
Caracterizamos comunidades fúngicas do solo em nove países em seis continentes usando ~4.000 amostras de solo e um protocolo desenvolvido em laboratório para o isolamento de leveduras e moldes. Este protocolo começa com enriquecimento seletivo separado para leveduras e o molde medicamente relevante Aspergillus fumigatus, em mídia líquida enquanto inibe o crescimento bacteriano. As colônias resultantes são então transferidas para mídias sólidas e processadas para obter culturas puras, seguidas pela caracterização genética a jusante. A identidade das espécies de leveduras é estabelecida através do sequenciamento de sua região espacial transcrita interna (ITS) do aglomerado genético ribossômico nuclear RNA, enquanto a estrutura populacional global de A. fumigatus é explorada através da análise de marcadores microsatélites.
O protocolo foi aplicado com sucesso para isolar e caracterizar as populações de leveduras de solo e A. fumigatus nos Camarões, Canadá, China, Costa Rica, Islândia, Peru, Nova Zelândia e Arábia Saudita. Esses achados revelaram insights muito necessários sobre padrões globais na diversidade de leveduras do solo, bem como estrutura populacional global e perfis de resistência antifúngica de A. fumigatus. Este artigo apresenta o método de isolar as duas leveduras e a. fumigatus de amostras internacionais de solo.
Introduction
Os fungos nos ecossistemas do solo desempenham papéis essenciais na decomposição da matéria orgânica, no ciclismo de nutrientes e na fertilização do solo1. Tanto abordagens independentes da cultura (ou seja, sequenciamento de alto rendimento) quanto abordagens dependentes da cultura são amplamente utilizadas no estudo dos fungos do solo 2,3. Embora a grande quantidade de dados gerados pelo sequenciamento de metabarcode de alto rendimento seja útil para a elucidação de padrões em larga escala na estrutura comunitária e na diversidade, a abordagem dependente da cultura pode fornecer informações altamente complementares sobre as estruturas taxonômicas e funcionais das comunidades fúngicas, bem como perfis mais específicos de organismos individuais através da diversidade a jusante e análises funcionais devido à disponibilidade de culturas fúngicas puras.
Apesar de raramente exceder milhares de células por grama de solo, as leveduras, amplamente definidas como fungos unicelulares, são decompodoras essenciais e fontes de alimento para outros moradores do solo 4,5. Na verdade, as leveduras podem ser os fungos do solo predominantes em biosferas frias, como a Antártida continental 6,7. O solo também é um reservatório primário de leveduras medicamente relevantes que causam infecções oportunistas graves em humanos e outros mamíferos8. Apesar das semelhanças morfológicas, as espécies de levedura são filogeneticamente diversas e ocorrem entre fungos filamentosos em dois filos, Ascomycota e Basidiomycota, dentro do reino fúngico9. As leveduras não possuem uma assinatura de DNA definidora no gene de codificação de barras fúngicas, a região interna do espaçador transcrito (ITS) do aglomerado genético RNA ribossômiconuclear 10, tornando-as indistinguíveis de outros fungos em investigações metagenômicas e, assim, exigindo o uso de métodos dependentes da cultura para isolar espécies de leveduras.
O protocolo abaixo foi implementado para caracterizar comunidades de leveduras de solo de nove países e identificar tendências e padrões globais na diversidade de leveduras do solo 9,11,12. As abordagens metagenômicas são de uso limitado ao estudar grupos direcionados de organismos como leveduras 2,3. Devido à sua diversidade filogenética, as leveduras não podem ser distinguidas de outros fungos baseados apenas na sequência de DNA. Assim, estudar populações de leveduras requer o uso contínuo do isolamento dependente da cultura. No entanto, a cultura é muitas vezes significativamente mais demorada e requer mais pessoal para realizar os experimentos. Portanto, o protocolo foi otimizado e simplificado para um processamento mais rápido com pessoal limitado. A principal vantagem da colheita é que as espécies de leveduras identificadas são leveduras vivas e não mortas, e, portanto, são mais propensas a serem verdadeiros moradores do solo do que células transitórias presentes nos solos. Estima-se que aproximadamente 40% do DNA fúngico no solo são contaminantes de outros ambientes, extracelulares, ou vêm de células que não estão mais intactas, causando abordagens de sequenciamento de alto rendimento para superestimar a riqueza fúngica em até 55%13. O isolamento dependente da cultura pode confirmar prontamente a identidade das espécies de leveduras com o benefício adicional de garantir a cultura pura para ser usada em análises a jusante. De fato, culturas puras de 44 espécies putativas de novas leveduras foram identificadas usando este protocolo de isolamento do solo que permitiu o uso de uma série de métodos para estudar suas propriedades taxonômicas e funcionais no detalhe14.
O protocolo abaixo também pode ser usado para isolar moldes presentes no solo, como A. fumigatus. Aspergillus fumigatus é um molde termofílico e saprofítico com ampla distribuição global no solo15. Foi isolado de inúmeros ambientes clínicos e não clínicos. A amostragem não clínica geralmente inclui ar, detritos orgânicos (composto, pó de serra, resíduos de bulbos de tulipas) e solo (solos agrícolas, de jardim e naturais)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus é um patógeno oportunista humano que causa uma série de infecções coletivamente denominadas aspergillose, afetando mais de 8 milhões de pessoas em todo o mundo, 16,20. Aproximadamente 300.000 pessoas em todo o mundo sofrem de aspergillose invasiva, que é a forma mais grave de aspergillose16. Dependendo de fatores como a população do paciente, local de infecção e eficácia da terapia antifúngica, a taxa de mortalidade pode ser de até 90%. Nas últimas décadas, a resistência às terapias antifúngicas aumentou, exigindo esforços globais de vigilância tanto em populações clínicas quanto ambientais para rastrear esses genótipos de resistência 21,22,23. Dada a sua capacidade de crescer a temperaturas acima de 50 °C, esta temperatura pode ser explorada para selecionar para A. fumigatus isolados do solo usando métodos dependentes da cultura. Os isolados aspergillus fumigatus são comumente genótipos em nove loci de repetição de tandem curto altamente polimórfico (STR), mostrando ter alto poder discriminatório entre cepas24. Esses genótipos str podem ser comparados com outras populações previamente pesquisadas para rastrear a disseminação de genótipos A. fumigatus, incluindo genes de resistência a drogas, em todo o mundo.
Abaixo descrevemos um protocolo para o isolamento rápido de leveduras e A. fumigatus a partir de amostras de solo de forma dependente da cultura. Dependendo da quantidade de solo obtida por amostra, as amostras de solo podem ser compartilhadas entre os dois protocolos. Em comparação com métodos similares que isolam leveduras e A. fumigatus do solo, este protocolo utiliza 10x menos solo por isolado obtido. Estudos que tentam isolar A. fumigatus do solo requerem entre 1 e 2 g de solo por isolante, enquanto este protocolo requer apenas 0,1-0,2 g de solo 18,19,25. Este protocolo utiliza plásticos e recipientes menores que facilitam seu design de alta produtividade. Portanto, um número maior de amostras pode ser processado usando menos espaço para equipamentos como incubadoras e tambores de rolo. As amostras de solo podem ser totalmente processadas para obter isolados em apenas 7 dias. Este protocolo foi otimizado para permitir o processamento de até 150-200 amostras por dia por pessoa.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo desenvolvido para isolar leveduras e A. fumigatus do solo é um método rápido e eficiente para processamento de solo de alto rendimento e isolamento fúngico. O protocolo requer apenas uma pequena quantidade de solo (0,1-0,2 g) por amostra, permitindo que mais locais sejam amostrados com esforço semelhante. O tempo de retorno rápido garante que os resultados possam ser obtidos em um curto espaço de tempo e permite tempo para solução de problemas e repetição de experimentos, se necessário. E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (Grant No. ALLRP 570780-2021) e Universidade McMaster.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
References
- Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
- Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
- Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
- Yurkov, A. M. Yeasts of the soil – obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
- Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
- Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
- Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
- Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. . The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).
- Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
- Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
- Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
- Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
- Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
- Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
- Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
- Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
- Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
- Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
- Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
- Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
- de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
- Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
- Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
- Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. 遗传学. 111 (4), 715-734 (1985).
- Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
- Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
- De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
- Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
- Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
- Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
- Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
- Wang, H. -. C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).
