Coloration rapide de Golgi pour la visualisation de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le cortex préfrontal
Summary
Le protocole décrit une modification de la méthode rapide de Golgi, qui peut être adaptée à n’importe quelle partie du système nerveux, pour colorer les neurones de l’hippocampe et du cortex préfrontal médian du rat.
Abstract
L’imprégnation golgi, utilisant le kit de coloration Golgi avec des adaptations mineures, est utilisée pour imprégner les épines dendritiques dans l’hippocampe du rat et le cortex préfrontal médian. Cette technique est une amélioration marquée par rapport aux méthodes précédentes d’imprégnation de Golgi car les produits chimiques prémélangés sont plus sûrs à utiliser, les neurones sont toujours bien imprégnés, il y a beaucoup moins de débris de fond et, pour une région donnée, il existe des écarts extrêmement faibles dans la densité de la colonne vertébrale entre les expériences. De plus, les cerveaux peuvent être accumulés après un certain point et conservés congelés jusqu’à un traitement ultérieur. En utilisant cette méthode, toute région du cerveau d’intérêt peut être étudiée. Une fois tachée et recouverte glissée, la densité de la colonne vertébrale dendritique est déterminée en comptant le nombre d’épines pour une longueur de dendrite et exprimée en densité de colonne vertébrale par dendrite de 10 μm.
Introduction
La méthode d’utilisation du dichromate de potassium et du nitrate d’argent pour marquer les neurones a été décrite pour la première fois par Camillo Golgi 1,2 et ensuite utilisée par Santiago Ramon y Cajal pour produire un immense corpus de travaux différenciant les sous-types neuronaux et gliaux. Un livre récemment publié avec ses illustrations est maintenant disponible3. Suite aux études de Ramon y Cajal, qui ont été publiées il y a plus de 100 ans, très peu d’imprégnation Golgi a été utilisée. L’imprégnation de Golgi est un processus laborieux qui permet la visualisation tridimensionnelle des neurones avec un microscope optique. Il y a eu de nombreuses modifications de la méthode Golgi au fil des ans pour rendre la méthode plus facile et la coloration plus cohérente4. En 1984, Gabbott et Somogyi5 ont décrit la procédure d’imprégnation golgi à section unique qui a permis un traitement plus rapide. Cette méthode d’imprégnation de Golgi nécessite une perfusion avec 4% de paraformaldéhyde et 1,5% d’acide picrique, post-fixation suivie d’une coupe vibratome dans un bain de dichromate de potassium à 3%. Les sections sont montées sur des lames de verre, les quatre coins des couvercles collés de sorte que lorsqu’ils sont immergés dans du nitrate d’argent, la diffusion est progressive. Les couvercles sont ensuite enlevés, les sections sont déshydratées et finissent par glisser définitivement avec un support de montage. Cette technique a été utilisée avec succès pour marquer les neurones et la glie 6,7,8 dans l’hippocampe. La méthode rapide de Golgi décrite ici est une amélioration car il y a beaucoup moins d’exposition au dichromate de potassium et au nitrate d’argent et aucun paraformaldéhyde et acide picrique ne sont utilisés. De plus, bien que les cellules imprégnées à l’aide de modifications de la méthode Gabbott et Somogyi5 puissent être analysées, les sections étaient souvent surexposées ou sous-exposées ou tombaient des lames pendant l’étape de déshydratation et généralement, plusieurs expériences devaient être regroupées pour avoir suffisamment de cellules pour l’analyse.
Le présent protocole décrit l’utilisation du kit de coloration golgi (voir Tableau des matériaux) pour étiqueter les dendrites et les épines dendritiques dans l’hippocampe et le cortex préfrontal médian (mPFC) du rat. Les avantages de cette méthode par rapport aux précédentes sont qu’elle est rapide, qu’il y a moins d’exposition aux produits chimiques nocifs pour le chercheur et qu’il y a une coloration constante des neurones. Le protocole décrit ci-dessous a été utilisé avec des modifications mineures pour évaluer la densité de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le mPFC du rat dans de nombreuses études 9,10,11,12,13,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent protocole décrit une méthode d’imprégnation de Golgi qui permet un traitement simultané rapide de nombreuses sections. Il s’agit d’une amélioration par rapport aux5 méthodes plus intensives en main-d’œuvre décrites précédemment et donne systématiquement des neurones imprégnés pour l’analyse. En outre, il y a moins d’exposition aux produits chimiques toxiques utilisés dans l’imprégnation de Golgi. La partie la plus difficile du processus consiste à faire en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. . The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , 208 (2017).
- Dall’Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The ‘single’ section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
