Summary

Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Published: December 03, 2021
doi:

Summary

Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.

Abstract

Die Golgi-Imprägnierung unter Verwendung des Golgi-Färbesets mit geringfügigen Anpassungen wird verwendet, um dendritische Stacheln im Hippocampus der Ratte und im medialen präfrontalen Kortex zu imprägnieren. Diese Technik ist eine deutliche Verbesserung gegenüber früheren Methoden der Golgi-Imprägnierung, da die vorgemischten Chemikalien sicherer zu verwenden sind, Neuronen durchweg gut imprägniert sind, es viel weniger Hintergrundablagerungen gibt und für eine bestimmte Region extrem kleine Abweichungen in der Wirbelsäulendichte zwischen den Experimenten auftreten. Darüber hinaus können Gehirne ab einem bestimmten Punkt akkumuliert und bis zur Weiterverarbeitung eingefroren gehalten werden. Mit dieser Methode kann jede interessierende Hirnregion untersucht werden. Nach der Färbung und dem Verrutschen der Abdeckung wird die dendritische Wirbelsäulendichte bestimmt, indem die Anzahl der Stacheln für eine Länge von Dendrit gezählt und als Wirbelsäulendichte pro 10 μm Dendrit ausgedrückt wird.

Introduction

Die Methode, Kaliumdichromat und Silbernitrat zur Markierung von Neuronen zu verwenden, wurde zuerst von Camillo Golgi1,2 beschrieben und anschließend von Santiago Ramon y Cajal verwendet, um eine immense Arbeit zur Unterscheidung neuronaler und glialer Subtypen zu produzieren. Ein kürzlich erschienenes Buch mit seinen Illustrationen ist jetzterhältlich 3. Nach den Studien von Ramon y Cajal, die vor mehr als 100 Jahren veröffentlicht wurden, wurde nur sehr wenig Golgi-Imprägnierung verwendet. Die Golgi-Imprägnierung ist ein mühsamer Prozess, der die dreidimensionale Visualisierung von Neuronen mit einem Lichtmikroskop ermöglicht. Es gab im Laufe der Jahre zahlreiche Modifikationen der Golgi-Methode, um die Methode zu erleichtern und die Färbung konsistenterzu machen 4. 1984 beschrieben Gabbott und Somogyi5 das einteilige Golgi-Imprägnierverfahren, das eine schnellere Verarbeitung ermöglichte. Diese Golgi-Imprägniermethode erfordert eine Perfusion mit 4% Paraformaldehyd und 1,5% Picrinsäure, gefolgt von der Vibratom-Schnitt in ein Bad aus 3% Kaliumdichromat. Abschnitte werden auf Glasobjektträger montiert, die vier Ecken der Deckgläser so verklebt, dass beim Eintauchen in Silbernitrat die Diffusion allmählich erfolgt. Anschließend werden Deckgläser abgenommen, Abschnitte dehydriert und schließlich mit Montagemedium dauerhaft verrutscht. Diese Technik wurde erfolgreich eingesetzt, um Neuronen und Glia 6,7,8 im Hippocampus zu markieren. Die hier beschriebene schnelle Golgi-Methode ist eine Verbesserung, da sowohl Kaliumdichromat als auch Silbernitrat weitaus geringer ausgesetzt sind und kein Paraformaldehyd und keine Pikrinsäure verwendet werden. Obwohl Zellen, die mit Modifikationen der Gabbott- undSomogyi-5-Methode imprägniert wurden, analysiert werden konnten, waren die Abschnitte während des Dehydratisierungsschritts oft über- oder unterbelichtet oder fielen von den Objektträgern und im Allgemeinen mussten mehrere Experimente gepoolt werden, um genügend Zellen für die Analyse zu haben.

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung des Golgi-Färbesets (siehe Materialtabelle) zur Kennzeichnung von Dendriten und dendritischen Stacheln im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex (mPFC) der Ratte. Die Vorteile dieser Methode gegenüber früheren sind, dass sie schnell ist, es weniger Exposition gegenüber schädlichen Chemikalien für den Forscher gibt und es eine konsistente Färbung von Neuronen gibt. Das unten beschriebene Protokoll wurde mit geringfügigen Modifikationen verwendet, um die dendritische Wirbelsäulendichte im Hippocampus und mPFC der Ratte in vielen Studien 9,10,11,12,13,14,15 zu beurteilen.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren sind vom Institutional Animal Care and Use Committee der Sacred Heart University genehmigt und entsprechen dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren. 1. Isolierung und Infiltration von Hirngewebe Premixen Sie die Lösungen A und B des Golgi Färbesets 24 h vor Gebrauch und bewahren Sie sie in dunklen Flaschen und/oder im Dunkeln auf. Machen Sie ungefähr 80 ml Lösung A und B Mischung, die ausreicht, um die Lösung nac…

Representative Results

Mit der schnellen Golgi-Methode werden Zellen durchweg gut imprägniert, so dass genügend Zellen zu analysieren sind. Dies ist eine deutliche Verbesserung gegenüber früheren Methoden, bei denen Experimente gepoolt werden mussten, um genügend Daten für die Analyse zu erhalten. Daher können mehr Proben auf einmal verarbeitet werden und Gehirne können bis zur Verarbeitung eingefroren gelagert werden. Beispiele für Golgi-imprägnierte Zellen in der CA1-Region des Hippocampus sind in Abbildung 3</…

Discussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode der Golgi-Imprägnierung, die eine schnelle gleichzeitige Verarbeitung vieler Abschnitte ermöglicht. Es ist eine Verbesserung gegenüber zuvor beschriebenen5 arbeitsintensiveren Methoden und liefert durchweg imprägnierte Neuronen für die Analyse. Darüber hinaus ist die Exposition gegenüber giftigen Chemikalien, die bei der Golgi-Imprägnierung verwendet werden, geringer. Der schwierigste Teil des Prozesses besteht darin, die Abschnitte auf den…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Sacred Heart University Undergraduate Research Initiative unterstützt.

Materials

Cardboard slides trays Fisher Scientific 12-587-10
Coverslips 24 x 60mm Fisher Scientific 12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit FD Neurotechnologies PK 401 Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray Fisher Scientific 23-022524
HISTO-CLEAR Fisher Scientific 50-899-90147 clearing agent
NCSS Software Kaysville, UT, USA
Permount Fisher Scientific SP-15-100 mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound Fisher Scientific 14-373-65 Used to mount brains on cryostat chuck

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Cite This Article
Frankfurt, M., Bowman, R. Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex. J. Vis. Exp. (178), e63404, doi:10.3791/63404 (2021).

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