Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule S. cerevisiae

Summary

La cinesina mitotica bidirezionale-5 Cin8 si accumula in ammassi che si dividono e si fondono durante la loro motilità. L’accumulo negli ammassi cambia anche la velocità e la direzionalità di Cin8. Qui viene descritto un protocollo per saggi di motilità con Cin8-GFP purificato e analisi delle proprietà mobili di singole molecole e cluster di Cin8.

Abstract

I motori mitotici bipolari kinesin-5 svolgono funzioni essenziali nella dinamica del mandrino. Questi motori presentano una struttura omo-tetramerica con due coppie di domini motori catalitici, situati alle estremità opposte del complesso attivo. Questa architettura unica consente ai motori kinesin-5 di reticolare e far scorrere i microtubuli antiparallelo del mandrino (MT), fornendo così la forza diretta verso l’esterno che separa i poli del mandrino. In precedenza, si riteneva che i motori kinesin-5 fossero esclusivamente diretti verso il plus-end. Tuttavia, studi recenti hanno rivelato che diversi motori fungini kinesin-5 sono meno diretti a livello di singola molecola e possono cambiare direzionalità in varie condizioni sperimentali. Il Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 è un esempio di tale proteina motoria bidirezionale: in condizioni di elevata forza ionica singole molecole di Cin8 si muovono nella direzione meno-estremità delle MT. È stato anche dimostrato che Cin8 forma ammassi mobili, prevalentemente all’estremità negativa delle MT, e tale clustering consente a Cin8 di cambiare direzionalità e subire una motilità lenta e diretta plus-end. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per tutte le fasi di lavoro con kinesin-5 Cin8 con tag GFP, dalla sovraespressione proteica nelle cellule di S. cerevisiae e la sua purificazione al saggio di motilità a singola molecola in vitro . Un metodo di nuova concezione qui descritto aiuta a distinguere tra singole molecole e cluster di Cin8, in base alla loro intensità di fluorescenza. Questo metodo consente un’analisi separata della motilità di singole molecole e cluster di Cin8, fornendo così la caratterizzazione della dipendenza della motilità di Cin8 dalla sua dimensione del cluster.

Introduction

Un gran numero di eventi di motilità all’interno delle cellule eucariotiche sono mediati dalla funzione delle proteine motorie molecolari. Questi motori si muovono lungo i filamenti citoscheletrici, i filamenti di actina e i microtubuli (MT) e convertono l’energia chimica dell’idrolisi dell’ATP in forze cinetiche e meccaniche necessarie per guidare la motilità biologica all’interno delle cellule. La S. cerevisiae Cin8 basata su MT è una proteina motoria bipolare omotetramerica kinesin-5 che reticola e fa scorrere le MT a parte¹. Cin8 svolge funzioni essenziali durante la mitosi, nell’assemblaggio del mandrino ^2,3,4 e nell’allungamento del mandrino durante l’anafase ^5,6,7. In precedenza, era stato dimostrato che Cin8 è un motore bidirezionale, che commuta la direzionalità in diverse condizioni sperimentali. Ad esempio, in condizioni di elevata resistenza ionica, i singoli motori Cin8 si muovono verso l’estremità negativa degli MT, mentre nei cluster, nei saggi di scorrimento MT multimotore e tra GLI MT antiparallelo, i motori Cin8 si muovono principalmente verso le estremità più degli MT 8,9,10,11,12 . Questi risultati sono stati altamente inaspettati a causa di diversi motivi. In primo luogo, Cin8 porta il suo dominio motorio catalitico all’ammino-terminale e tali motori erano precedentemente ritenuti esclusivamente diretti verso il plus-end, mentre Cin8 ha dimostrato di essere minus-end diretto a livello di singola molecola. In secondo luogo, si credeva che i motori kinesin fossero unidirezionali, diretti meno-end o plus-end, mentre Cin8 si è dimostrato bidirezionale, a seconda delle condizioni sperimentali. Infine, a causa dell’orientamento MT al mandrino mitotico, il ruolo classico dei motori kinesin-5 nella separazione dei poli del mandrino durante l’assemblaggio del mandrino e l’anafase B potrebbe essere spiegato solo dalla loro motilità diretta plus-end sugli MT che reticolano ^1,13. A seguito dei primi rapporti sulla bidirezionalità di Cin8, alcuni altri motori kinesin sono stati dimostrati bidirezionali ^14,15,16, indicando che la motilità bidirezionale dei motori kinesin potrebbe essere più comune di quanto si credesse in precedenza.

È stato precedentemente riportato che nelle cellule, Cin8 si muove anche in modo bidirezionale⁸, sostenendo l’idea che la motilità bidirezionale di alcuni motori kinesin-5 sia importante per le loro funzioni intracellulari. Inoltre, poiché i tre motori kinesin-5 che sono stati segnalati come bidirezionali provengono da cellule fungine, un possibile ruolo per la bidirezionalità dei motori kinesin-5 è stato recentemente proposto in tali cellule¹⁰. Secondo questo modello, nella mitosi chiusa delle cellule fungine, dove l’involucro nucleare non si rompe durante la mitosi, i motori kinesin-5 forniscono la forza iniziale che separa i poli del mandrino prima dell’assemblaggio del mandrino. Per eseguire questo compito, prima della separazione dei poli del mandrino, i motori kinesin-5 si localizzano vicino ai poli del mandrino, per la loro motilità diretta all’estremità inferiore su singoli MT nucleari. Una volta in questa posizione, i motori kinesin-5 si raggruppano, commutano la direzionalità, catturano e collegano incrociato i NET dai poli del mandrino vicini. Successivamente, i motori kinesin-5 forniscono la separazione iniziale dei poli mediante motilità diretta plus-end sugli MT che reticolano. Con questo modello, sia la motilità diretta minus-end su singoli MT che la motilità diretta plus-end su MT reticolati durante lo scorrimento antiparallelo sono necessarie affinché i motori fungini kinesin-5 svolgano i loro ruoli nell’assemblaggio mandrino ^1,13.

L’obiettivo generale del metodo descritto è quello di ottenere kinesin-5 Cin8 fungina di elevata purezza marcata con GFP e di eseguire saggi di motilità a singola molecola (Figura 1) analizzando separatamente la motilità di singole molecole e cluster di Cin8. La separazione tra singole molecole e cluster è importante poiché uno dei fattori che ha dimostrato di influenzare la direzionalità di Cin8 è il suo accumulo in cluster sulle MT^10,12. Saggi di motilità alternativi, come i saggi di scorrimento superficiale MT e MT sliding non forniscono informazioni sull’attività delle proteine monomotore^17,18. I robusti metodi di analisi e analisi della motilità a singola molecola qui descritti sono stati applicati con successo per caratterizzare diversi aspetti dei motori kinesin-5, Cin8 e Kip1 10,11,12,14,19,20.

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per la sovraespressione e la purificazione di Cin8, la polimerizzazione delle MT e il test di motilità a singola molecola. Inoltre, vengono descritte anche le analisi per differenziare tra singole molecole e cluster di Cin8 e per determinare le velocità di singolo motore e cluster mediante l’analisi dello spostamento medio (MD) e dello spostamento quadrato medio (MSD). Questo protocollo ha lo scopo di aiutare i ricercatori a visualizzare tutte le fasi delle procedure e assistere nella risoluzione dei problemi di questo tipo di test.

Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di motilità a singola molecola. Le MT fluorescenti biotinilate sono attaccate alla superficie del vetro, rivestite con Avidin che interagisce con il BSA biotinilato attaccato alla superficie. La freccia verde rappresenta la direzione del movimento di singole molecole Cin8 in condizioni di elevata forza ionica. +/- rappresenta la polarità della MT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Preparazione di tamponi e reagenti Buffer -Leu aa dropout mix: mescolare 2 g ciascuno di adenina, uracile, triptofano, istidina, lisina e metionina e conservare a temperatura ambiente. Mezzo selettivo di lievito con raffinosio (1 L): Mescolare 6,7 g di base di azoto lievitato (con solfato di ammonio), 2 g di miscela di -Leu aa dropout e 20 g di raffinosio in acqua a doppia distillazione mescolando (senza riscaldamento) fino a completa dissoluzione. Utilizzando un filtro da…

Representative Results

L’esperimento mira a studiare le caratteristiche di motilità della proteina motoria bidirezionale Cin8 di diverse dimensioni di cluster su singoli MT. La motilità rappresentativa di Cin8-GFP è evidente anche dai chimografi in Figura 5A, dove viene mostrata la posizione spaziale del motore nel tempo. Per l’analisi delle proprietà mobili di Cin8-GFP, in primo luogo, la dimensione del cluster viene assegnata (passo 4.3) a ciascuna particella cin8-GFP mobile attac…

Discussion

In questo lavoro, viene presentato un protocollo per il saggio di motilità a singola molecola con la kinesin-5 bidirezionale Cin8 e l’analisi della motilità. Il Cin8¹⁸ a lunghezza intera, incluso il segnale di localizzazione nucleare nativo (NLS) al C-terminale, è stato purificato dall’ospite nativo S. cerevisiae. Poiché il Cin8 è una proteina del motore nucleare, la macinazione delle cellule S. cerevisiae sotto azoto liquido è il metodo più efficiente per la lisi cellular…

Materials

Adenine	FORMEDIUM	DOC0230
ATP	Sigma	A7699
Biotinylated-BSA	Sigma	A8549
Casein	Sigma	C7078
Catalase (C40)	Sigma	C40
Creatine-Kinase	Sigma	C3755
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
EDTA	Sigma	E5134
EGTA	Sigma	E4378
Fluorescence filter set for GFP	Chroma	49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine	Chroma	49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope	Zeiss	Axiovert 200M
Galactose	Tivan Biotech	GAL02
Glucose	Sigma	G8270
Glucose Oxidase	Sigma	G7141
Glycerol	Sigma	G5516
GlycylGlycine	Merck	G0674
GMPCPP	Jana Bioscience	Nu-405L
GTB	Cytoskeleton	BST01-010
GTP	Sigma	G8877
Histidine	Duchefa Biochemie	H0710.0100
ImageJ-FIJI software	https://imagej.net/plugins/trackmate/	version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole	Sigma	I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain	Abcam	ab119211
Lens	Zeiss	100x/1.4 oil DIC objective
Lysine	FORMEDIUM	DOC0161
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
Methionine	Duchefa Biochemie	M0715.0100
Neo	Andor Technologies	sCMOS camera
NeutraAvidin	Life	A2666
Ni-NTA Agarose	Invitrogen	R901-15
Phospho-Creatine	Sigma	P1937
Pipes	Sigma	P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer)	Sigma	P2443
Potassium Chloride	Sigma	P9541
Raffinose	Tivan Biotech	RAF01
Size Exclusion chromatography instument	GE Healthcare	AKTA Pure
Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	NanoDrop
Superose-6 10/300 GL	GE Healthcare	17-5172-01
Tris	Roshe	10708976001
Triton X-100	Sigma	T8787
Tryptophan	Duchefa Biochemie	T0720.0100
Tubulin protein	Cytoskeleton	T240
Tubulin, biotinylated	Cytoskeleton	T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine	Cytoskeleton	TL530M
Uracil	Sigma	U0750-100G
Yeast nitrogen base	FORMEDIUM	CYN0401S
α-GFP antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC8036
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148