大规模、自动化生产脂肪来源的干细胞球体，用于 3D 生物打印

Summary

在这里，我们描述了使用自动移液系统接种细胞悬浮液的脂肪衍生基质/干细胞（ASC）球体的大规模生产，从而确保球体大小和形状的均匀性。这些ASC球体可用作3D生物打印方法的构建块。

Abstract

脂肪来源的基质/干细胞（ASCs）是在人皮下脂肪组织的基质血管部分中发现的细胞亚群，被认为是间充质基质/干细胞的经典来源。许多研究已经发表了用于基于支架的组织工程方法的ASC，其主要探索了这些细胞在生物活性支架上接种后的行为。然而，无支架方法正在出现，主要通过使用球体来设计 体外 和 体内的组织，以克服基于支架的方法的局限性。

球状体是由自组装过程形成的3D微组织。它们可以更好地模拟天然组织的结构和微环境，主要是由于细胞间和细胞与细胞外基质相互作用的放大。最近，主要探索球体作为疾病模型，药物筛选研究和3D生物打印的构建块。然而，对于3D生物打印方法，许多大小和形状均匀的球体对于生物制造复杂的组织和器官模型是必要的。此外，当自动产生球状体时，微生物污染的机会很小，从而提高了该方法的可重复性。

大规模生产球状体被认为是开发生物制造线的第一个强制性步骤，该生产线在3D生物打印过程中继续进行，并在生物反应器中完成组织构建的完全成熟。然而，探索大规模ASC球体生产的研究数量仍然很少，以及使用ASC球体作为3D生物打印构建块的研究数量。因此，本文旨在展示使用非粘性微成型水凝胶技术大规模生产ASC球体，将ASC球体作为3D生物打印方法的构建块。

Introduction

球状体被认为是组织工程中的无支架方法。ASC能够通过自组装过程形成球体。球体的3D微架构增加了ASC的再生潜力，包括分成多个谱系^{的能力1，2，3}。该研究小组一直在使用ASC球体进行软骨和骨组织工程^4，5，6。更重要的是，球状体被认为是组织和器官生物制造中的构建块，主要是因为它们的融合能力。

使用球状体进行组织形成取决于三个要点:（1）开发标准化和可扩展的机器人方法进行生物制造⁷，（2）组织球体的系统表型⁸，（3）开发3D组织组装方法⁹。这些球状体可以用不同的细胞类型形成，并通过各种方法获得，包括吊坠，重聚，微流体和微摩尔^8，9，10。这些方法中的每一种都有与球体大小和形状的均匀性，....

Protocol

本研究中使用的ASC以前是从健康的人类供体中分离出来的，并根据巴西里约热内卢联邦大学克莱门蒂诺·弗拉加·菲略大学医院的研究伦理委员会（25818719.4.0000.5257^）的描述 14进行冷冻保存。有关本研究中使用的所有材料和设备的详细信息，请参阅 材料表 。

1. ASC单层在三通道时的胰蛋白酶消化

1. 打开含有80%汇合的ASC单层的175厘米² 烧瓶的组织培养物，并丢弃上清液。
2. 加入7 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.01 M）并洗涤单层两次。接下来，丢弃液体。
3. 加入 5 mL 0.125% 胰蛋白酶和 0.78 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA）。接下来，在37°C下孵育5分钟。
4. 将10 mL 低葡萄糖 杜贝克的改良鹰培养基（DMEM LOW）与10%胎牛血清（FBS）加入组织培养175 cm² 烧瓶中，并用10mL索理移液管将细胞悬浮液充分混合。
5. 用10 mL血清移液器收获细胞悬浮液并将其转移到50 mL离心管中。接下来，在400× g 下离心5分钟以获得ASC的沉淀。使用含有10%FBS的DMEM 低 重悬细胞沉淀。
6. 通....

Results

自动移液系统可以在15分钟内将ASC细胞悬浮液接种到一个12孔板的12个孔中。使用81微成型的非粘附水凝胶将在方案结束时产生972个球体。使用256微成型的非粘附水凝胶将在方案结束时产生3，072个球状体。分析ASC球体的尺寸和形状的均匀性。来自具有81个衰退的微模具的ASC球状体在培养期间显示出均匀的直径，而来自具有256个衰退的微成型物的ASC球体（图1C，D）。最小和最大直径（球形）的比率接近1，在微霉菌的ASC球体中，有81和256个衰退（图1E，F）。活力、形态学和力分析的结果（图2）为ASC球体的成功大规模生产提供了证据。

Discussion

本文介绍了使用自动移液器系统大规模生成ASC球体。该协议的关键步骤是精确设置软件，以确保正确的细胞悬浮液体积，速度和移液距离。方案中描述的参数是在多次试验后确定的，以优化ASC细胞悬浮液分配到含有微成型，非粘附水凝胶的12孔板的孔中。通过测量球体的直径和球形度来评估优化。微成型非贴壁水凝胶的面积和高度用于计算分配细胞悬浮液的理想速度。如果细胞悬浮液由设备以不同的分配速度接种，这将直接影响球体的形成。因此，这些是在设备试用后需要优化的关键参数。此协议有一些限制。只有在微成型品中的非贴壁水凝胶中接种ASC才能自动化，然后添加细胞培养基。系统的功能受到设备和软件版本的限制。然而，这种可重复方法的主要优点是可以产生多达3，072个ASC球体 - 大小和形状均匀且可行 - 人为错误或污染的风险很小。大量的生物制造的ASC球体可以直接加载到3D生物打印机中，以产生更复杂的组织模型。

一般而言，众所周知，准确和自动化的移液在细胞培养的自动化中起着核心作用。自动化细胞培养系统可实现大规模生产，并提高技术准确性、可重复性和工艺效率¹⁵.因此，自动化系统.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 孔塑料板	康宁	3512
50 mL 离心管	康宁	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S.Motion	Eppendorf	30015231
乙二胺四乙酸 （EDTA）	Invitrogen	15576028
胎牛血清 （FBS）	Gibco	10082147
低葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM LOW）	Gibco	31600034
微量组织 3D 培养皿微塑球 - 16 x 16 阵列	Sigma
MicroTissues 3D 培养皿 微塑球 - 9 x 9 阵列	Sigma	Z764019
磷酸盐水缓冲液 （PBS）	Sigma	806552
氯化钠 （NaCl）	Sigma	S8776
组织培养瓶	康宁	430720U
台盼	Lonza	17-942E
胰蛋白酶	Gibco	27250018
超纯琼脂糖	Invitrogen	16500100