3Dバイオプリンティングのための脂肪由来幹細胞スフェロイドの大規模自動生産
Summary
ここでは、自動ピペッティングシステムを使用して細胞懸濁液を播種し、スフェロイドのサイズと形状の均質性を確保する脂肪由来間質/幹細胞(ASC)スフェロイドの大規模生産について説明します。これらのASCスフェロイドは、3Dバイオプリンティングアプローチのビルディングブロックとして使用できます。
Abstract
脂肪由来間質/幹細胞(ASC)は、間葉系間質/幹細胞の古典的な供給源として認識されているヒト皮下脂肪組織の間質血管画分に見られる細胞の亜集団である。足場ベースの組織工学的アプローチのためのASCを用いた多くの研究が発表されており、主に生理活性足場に播種した後のこれらの細胞の挙動を調査した。しかし、足場ベースのアプローチの限界を克服するために、主にスフェロイドを使用して、イン ビトロ および インビボで組織を設計するための足場フリーアプローチが出現しています。
回転楕円体は、自己組織化プロセスによって形成される3Dマイクロ組織である。それらは、主に細胞間および細胞対細胞間マトリックス相互作用の倍率のために、天然組織のアーキテクチャおよび微小環境をよりよく模倣することができる。最近、スフェロイドは主に疾患モデル、薬物スクリーニング研究、および3Dバイオプリンティングのビルディングブロックとして探求されています。しかし、3Dバイオプリンティングアプローチでは、複雑な組織および臓器モデルをバイオファブリケーションするために、サイズと形状が均質な多数の回転楕円体が必要です。さらに、スフェロイドが自動的に生成される場合、微生物学的汚染の可能性はほとんどなく、方法の再現性が向上します。
スフェロイドの大規模生産は、3Dバイオプリンティングプロセスで継続し、バイオリアクター内の組織構築物の完全な成熟で完了するバイオファブリケーションラインを開発するための最初の必須ステップと考えられています。しかし、ASCスフェロイドの大規模な生産を調査した研究の数は、ASCスフェロイドを3Dバイオプリンティングのビルディングブロックとして使用した研究の数とともに、まだ少ないです。したがって、本稿は、ASCスフェロイドを3Dバイオプリンティングアプローチのビルディングブロックとして広げる非接着マイクロモールドヒドロゲル技術を用いたASCスフェロイドの大規模生産を示すことを目的とする。
Introduction
回転楕円体は、組織工学における足場のないアプローチと考えられている。ASCは、自己組織化プロセスによって回転楕円体を形成することができる。回転楕円体の3Dマイクロアーキテクチャは、複数の系統への分化能力を含むASCの再生可能性を高めます1,2,3。この研究グループは、軟骨および骨組織工学のためのASCスフェロイド4,5,6に取り組んできました。さらに重要なことに、スフェロイドは、主にその融合能力のために、組織および器官のバイオファブリケーションにおけるビルディングブロックと考えられている。
組織形成のためのスフェロイドの使用は、(1)それらのバイオファブリケーションのための標準化されたスケーラブルなロボット法の開発7、(2)組織スフェロイド8の系統的表現型決定、(3)3D組織の組み立てのための方法の開発9の3つの主要なポイントに依存する。これらのスフェロイドは、異なる細胞型で形成することができ、吊り下げドロップ、再凝集、マイクロ流体、およびマイクロモールド8、9、10を含む様々な方法を介して得ることができる。これらの方法の各々は、スフェロイドのサイズおよび形状の均質性、形成後のスフェロイドの回収、生成されるスフェロイドの数、プロセスの自動化、労働強度、およびコスト11に関連する長所および短所を有する。
マイクロモールド法では、細胞は重力のためにマイクロモールドの底部に分配され、堆積される。非接着性ヒドロゲルは、細胞が底部に接着することを許さず、細胞間相互作用は、後退8,12当たりの単一のスフェロイドの形成をもたらす。このバイオファブリケーション方法は、均質で制御されたサイズのスフェロイドを生成し、最小限の労力で時間効率の高い方法で大規模生産のためにロボット化することができ、組織スフェロイドのバイオファブリケーションの設計において優れた費用対効果 – 重要な要素を有する7,8。この方法は、任意の細胞系譜のスフェロイドの形成に適用して、予測可能、最適、および制御可能な特性を有する新しい組織型を調製することができる8。
バイオファブリケーションは、「構造組織を有する生物学的に機能的な製品の自動生成…」13と定義されています。したがって、スフェロイドの自動生産は、3Dバイオプリンティングプロセスを継続し、スフェロイド融合によるバイオプリント組織の完全な成熟で終了するバイオファブリケーションラインを開発するための最初の必須ステップと考えられています。この研究では、ASCスフェロイドバイオファブリケーションのスケーラビリティを向上させるために、自動ピペッティングシステムを使用して細胞懸濁液を播種し、スフェロイドのサイズと形状の均質性を確保します。この論文は、より複雑な組織モデルをバイオファブリケーションするための3Dバイオプリンティングアプローチに必要な多数の(数千)スフェロイドを生成することが可能であったことを示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
この論文では、自動ピペットシステムを使用したASCスフェロイドの大規模生成について説明します。このプロトコルの重要なステップは、ピペッティングのための細胞懸濁液の正しい量、速度、および距離を保証するためにソフトウェアを正確にセットアップすることです。プロトコールに記載されたパラメータは、マイクロモールドされた非付着性ヒドロゲルを含む12ウェルプレートのウ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、国立計量・品質・技術研究所(INMETRO、RJ、ブラジル)の施設の使用に感謝する。この研究は、リオデジャネイロ州研究支援のためのカルロス・シャガス・フィーリョ財団(Faperj)(財務コード:E26/202.682/2018およびE-26/010.001771/2019)、国立科学技術開発評議会(CNPq)(財務コード:307460/2019-3)、および海軍研究局(ONR)(財務コード:N62909-21-1-2091)によって部分的に支援されました。この研究は、国立再生医療科学技術センター-INCTリジェネラ(http://www.inctregenera.org.br/)の支援を受けた。
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -. K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C – Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
