Produção automatizada em larga escala de esferoides de células-tronco derivados de adiposo para bioimpressão 3D
Summary
Aqui, descrevemos a produção em larga escala de esferoides esferoides de células-tronco derivados de adiposos (ASC) usando um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Estes esferoides ASC podem ser usados como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.
Abstract
Células-tronco/estromenas derivadas de adiposos (ASCs) são uma subpopulação de células encontradas na fração vascular estromada do tecido adiposo subcutâneo humano reconhecido como uma fonte clássica de células mesenquimais estromicas/tronco. Muitos estudos foram publicados com ASCs para abordagens de engenharia de tecidos baseadas em andaimes, que exploraram principalmente o comportamento dessas células após sua semeadura em andaimes bioativos. No entanto, abordagens livres de andaimes estão surgindo para projetar tecidos in vitro e in vivo, principalmente usando esferoides, para superar as limitações das abordagens baseadas em andaimes.
Os spheróides são microtissues 3D formados pelo processo de auto-montagem. Eles podem imitar melhor a arquitetura e o microambiente dos tecidos nativos, principalmente devido à ampliação das interações de matriz celular-célula e célula-extracelular. Recentemente, os esferoides estão sendo explorados principalmente como modelos de doenças, estudos de rastreamento de medicamentos e blocos de construção para bioimpressão 3D. No entanto, para abordagens de bioimpressão 3D, numerosos esferoides, homogêneos em tamanho e forma, são necessários para biofabricar tecidos complexos e modelos de órgãos. Além disso, quando os esferoides são produzidos automaticamente, há pouca chance de contaminação microbiológica, aumentando a reprodutibilidade do método.
A produção em larga escala de esferoides é considerada o primeiro passo obrigatório para o desenvolvimento de uma linha de biofabricação, que continua no processo de bioimpressão 3D e termina na maturação total do tecido construído em bioreatores. No entanto, o número de estudos que exploraram a produção de spheroid ASC em larga escala ainda são escassos, juntamente com o número de estudos que usaram esferoides ASC como blocos de construção para bioimpressão 3D. Portanto, este artigo tem como objetivo mostrar a produção em larga escala de esferoides ASC usando uma técnica de hidrogel micromoldado não adesivo que espalha os esferoides ASC como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.
Introduction
Os spheróides são considerados uma abordagem livre de andaimes na engenharia de tecidos. AsCs são capazes de formar esferoides pelo processo de auto-montagem. A microarquitetura 3D do spheroid aumenta o potencial regenerativo das ASCs, incluindo a capacidade de diferenciação em várias linhagens 1,2,3. Este grupo de pesquisa tem trabalhado com esferoides ASC para engenharia de cartilagem e tecido ósseo 4,5,6. Mais importante, os esferoides são considerados blocos de construção na biofabricação de tecidos e órgãos, principalmente devido à sua capacidade de fusão.
O uso de esferoides para formação de tecidos depende de três pontos principais: (1) o desenvolvimento de métodos robóticos padronizados e escaláveis para sua biofabricação7, (2) o fenotipagem sistemática dos esferoides teciduais8, (3) o desenvolvimento de métodos para a montagem de tecidos 3D9. Esses esferoides podem ser formados com diferentes tipos de células e obtidos através de vários métodos, incluindo queda de suspensão, reagregação, microfluidos e micromedes 8,9,10. Cada um desses métodos possui vantagens e desvantagens relacionadas à homogeneidade de tamanho e forma dos esferoides, recuperação dos esferoides após a formação, número de esferoides produzidos, automação de processos, intensidade de mão-de-obra e custos11.
No método micromold, as células são dispensadas e depositadas na parte inferior do micromold por causa da gravidade. O hidrogel não adesivo não permite que as células aderam ao fundo, e interações célula-célula levam à formação de uma única recessão por perifóide 8,12. Este método de biofabricação gera esferoides de tamanho homogêneo e controlado, pode ser robotizado para produção em larga escala de forma eficiente com esforço mínimo, e tem bons fatores críticos de custo-efetividade no projeto de uma biofabricação de tecido spheroid 7,8. Este método pode ser aplicado para formar esferoides de qualquer linhagem celular para preparar um novo tipo de tecido com características previsíveis, ótimas e controláveis8.
A biofabização é definida como “a geração automatizada de produtos biologicamente funcionais com organização estrutural…”13. Portanto, a produção automatizada de esferoides é considerada o primeiro passo obrigatório para o desenvolvimento de uma linha de biofabricação, que continua no processo de bioimpressão 3D e termina na maturação total do tecido bioimpresso pela fusão esferoide. Neste estudo, para melhorar a escalabilidade da biofabricação esferoide ASC, utilizamos um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Este artigo mostra que foi possível produzir um grande número (milhares) de esferoides necessários para abordagens de bioimpressão 3D para biofabricar modelos de tecidos mais complexos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo apresenta a geração em larga escala de esferoides ASC usando um sistema automatizado de pipetas. O passo crítico do protocolo é configurar precisamente o software para garantir o volume correto de suspensão, velocidade e distância da célula para a tubulação. Os parâmetros descritos no protocolo foram determinados após uma série de ensaios para otimizar a dispensa da suspensão da célula ASC nos poços de placas de 12 poços contendo os hidrogéis micromoedos e não aderentes. A otimização foi a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO, RJ) pelo uso de suas instalações. Este estudo foi parcialmente apoiado pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (Faperj) (Código financeiro: E26/202.682/2018 e E-26/010.001771/2019, o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (código financeiro: 307460/2019-3) e o Escritório de Pesquisa Naval (ONR) (código financeiro: N62909-21-1-2091). Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Centro Nacional de Ciência e Tecnologia em Medicina Regenerativa-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
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