Cultivos celulares primarios para estudiar el potencial de regeneración de la glía murina de Müller después del tratamiento con microARN

Summary

Los cultivos primarios de Müller glia obtenidos a partir de retinas de ratón representan una herramienta muy robusta y fiable para estudiar la conversión glial en células progenitoras de la retina tras el tratamiento con microARN. Las moléculas individuales o combinaciones pueden ser probadas antes de su posterior aplicación de enfoques in vivo .

Abstract

La glía de Müller (MG) es la glía predominante en la retina neural y puede funcionar como una fuente regenerativa para las neuronas retinianas. En vertebrados inferiores como los peces, la regeneración impulsada por MG ocurre naturalmente; en los mamíferos, sin embargo, se requiere estimulación con ciertos factores o manipulación genética/epigenética. Dado que la MG comprende solo el 5% de la población de células de la retina, existe la necesidad de sistemas modelo que permitan el estudio de esta población celular exclusivamente. Uno de estos sistemas modelo son los cultivos primarios de MG que son reproducibles y se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluida la detección e identificación de moléculas / factores, pruebas de compuestos o factores, monitoreo celular y / o pruebas funcionales. Este modelo se utiliza para estudiar el potencial de la MG murina para convertirse en neuronas de la retina después de la suplementación o inhibición de microARN (miARN) a través de la transfección de miARN artificiales o sus inhibidores. El uso de ratones reporteros específicos de MG en combinación con el marcado inmunofluorescente y la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) confirmó que el 80%-90% de las células encontradas en estos cultivos son MG. Usando este modelo, se descubrió que los miRNAs pueden reprogramar MG en células progenitoras de la retina (RPC), que posteriormente se diferencian en células similares a las neuronales. Las ventajas de esta técnica son que los candidatos a miRNA pueden ser probados por su eficiencia y resultado antes de su uso en aplicaciones in vivo .

Introduction

La glía de Müller (MG) es la glía predominante en la retina neural. Tienen funciones similares en comparación con otras glías en otras partes del sistema nervioso central, como mantener la homeostasis del agua y los iones, nutrir las neuronas y proteger el tejido. Las MG tienen otra característica fascinante: aunque son glía madura, todavía expresan muchos genes expresados en células progenitoras de la retina (RPC) durante el desarrollo tardío ^1,2. Se supone que esta semejanza es la razón de la regeneración neuronal natural basada en MG en la retina de los peces después del daño retiniano ^3,4. Durante este proceso, la MG vuelve a entrar en el ciclo celular y se desdiferencia en RPC que luego se diferencian en los seis tipos de neuronas retinianas. Aunque este fenómeno ocurre naturalmente en los peces, las MG de mamíferos no se convierten en neuronas ^5,6. Sin embargo, pueden reprogramarse. Se ha demostrado que una variedad de factores reprograman la MG en RPC/neuronas; entre estos factores se encuentra el factor de transcripción básico hélice-bucle-hélice (bHLH) homólogo 1 (Ascl1) que interviene en la regeneración de peces ^7,8. En ratones, Ascl1 solo se expresa en RPC durante la retinogénesis, pero está ausente en neuronas maduras mg o retinianas⁹.

La reprogramación de células directamente in vivo no solo es un desafío metodológico, sino que también requiere la aprobación de un comité institucional de cuidado y uso de animales. Para recibir la aprobación, se requieren datos preliminares sobre los factores utilizados o alterados, las concentraciones, los efectos fuera del objetivo, los mecanismos subyacentes, la toxicidad y la eficiencia. Los sistemas de cultivo celular permiten probar estos criterios antes de su uso en modelos in vivo. Además, dado que la MG solo comprende alrededor del 5% de toda la población de células retinianas¹⁰, los cultivos de MG permiten estudiar su función¹¹ así como su comportamiento, incluyendo la migración ^12,13, la proliferación¹⁴, la reacción al estrés ante una lesión/daño ^15,16, su interacción con otros tipos celulares como la microglía¹⁷ o las células ganglionares de la retina (RGC)¹⁸, o su potencial neurogénico 19,20,21. Muchos investigadores utilizan líneas celulares inmortalizadas para sus estudios, ya que tienen un potencial proliferativo ilimitado y pueden mantenerse y transfectarse fácilmente. Las células primarias, sin embargo, son preferibles para ensayos biológicamente relevantes que las células inmortalizadas, ya que tienen verdaderas características celulares (expresión de genes y proteínas) y, lo que es más importante, representan una cierta etapa en el desarrollo y, por lo tanto, tienen una “edad”. La edad de un animal (y en consecuencia de las células obtenidas de un animal) es un factor especialmente crucial en la reprogramación celular, ya que la plasticidad celular se reduce con la etapa avanzada de desarrollo²².

Este protocolo describe en detalle cómo reprogramar la MG primaria con miRNAs como un método in vitro actual para estudiar la regeneración. Este modelo de cultivo primario de MG se estableció en 2012 para evaluar las características de proliferación celular de MG en ratones knock-out P53 (ratones trp53-/-)²³. Se demostró que la MG cultivada mantiene sus características gliales (es decir, la expresión de las proteínas S100β, Pax6 y Sox2 evaluadas mediante el etiquetado inmunofluorescente), y que se asemejan a la MG in vivo (microarray de MG purificada por FACS)²³. Poco después, la expresión de ARNm glial y proteínas fue validada y confirmada en un enfoque diferente utilizando vectores virales²⁰. Unos años más tarde, se confirmó que la gran mayoría de las células encontradas en estos cultivos son MG mediante el uso del Rlbp1 específico de MG^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl reporter mouse²⁴. Además, la cuantificación del conjunto de miRNAs tanto en MG purificada por FACS como en MG primaria cultivada mostró que los niveles de mg miRNAs (mGLiomiRs) no varían mucho en MG cultivada durante la fase de crecimiento. Los períodos de cultivo alargados, sin embargo, causan cambios en los niveles de miRNA y, en consecuencia, en los niveles de ARNm y la expresión de proteínas, ya que los miRNAs son reguladores traslacionales²⁵.

En 2013, este modelo de cultivo de MG se utilizó para probar una variedad de factores de transcripción con respecto a su capacidad para reprogramar MG en neuronas retinianas²⁰. Se encontró que Ascl1 era un factor de reprogramación muy robusto y confiable. La sobreexpresión de Ascl1 a través de vectores virales indujo cambios morfológicos, expresión de marcadores neuronales y la adquisición de propiedades electrofisiológicas neuronales. Más importante aún, los conocimientos y resultados obtenidos de estos primeros experimentos in vitro se transfirieron con éxito a aplicaciones in vivo ^22,26 demostrando que los cultivos primarios de MG representan una herramienta sólida y confiable para el cribado factorial inicial y la evaluación de las características gliales antes de la implementación in vivo.

Hace unos años, se demostró que el miRNA miR-124 enriquecido con cerebro, que también está altamente expresado en las neuronas de la retina, puede inducir la expresión de Ascl1 en MG²¹ cultivado. La expresión de Ascl1 en células vivas se visualizó a través de un ratón reportero Ascl1 (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl). Un ratón reportero es un ratón genéticamente modificado que tiene un gen reportero insertado en su ADN. Este gen reportero codifica para una proteína reportera, que es en este estudio tdTomato, una proteína fluorescente roja. Esta proteína reportera informa de la expresión de un gen de interés, en este caso, Ascl1. En otras palabras, las células que expresan Ascl1 se volverán rojas. Dado que Ascl1 solo se expresa en RPC⁹, este ratón Ascl1^CreERT: tdTomato^{STOPfl / fl} permite el seguimiento de la conversión de MG en RPC que expresan Ascl1, lo que significa que las células convertidoras expresarán la proteína reportera tdTomato fluorescente roja. Este es un etiquetado irreversible ya que el ADN de estas células está alterado. En consecuencia, cualquier diferenciación neuronal posterior se visualizará porque la etiqueta tdTomato permanece en las células diferenciadoras. Si Ascl1 que expresa RPC derivados de MG (con etiqueta tdTomato) se diferencian en neuronas, estas neuronas aún tendrán su etiqueta roja. Este ratón, por lo tanto, permite no solo el etiquetado de RPC derivados de MG para imágenes de células vivas, sino que también permite el mapeo del destino y el rastreo de linaje de estos RPC derivados de MG (rojos). Más recientemente, se identificó el conjunto de miRNAs en RPC y se utilizaron cultivos MG de ratones Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl RPC-reporter para detectar y probar el efecto de estos miRNAs sobre la capacidad de reprogramación y la eficiencia²⁷. Un candidato, el RPC-miRNA miR-25, se encontró capaz de reprogramar la MG cultivada en células que expresan Ascl1 (Ascl1-Tomate+). Estas células reprogramadas adoptan características neuronales a lo largo del tiempo, incluida la morfología neuronal (somatas pequeños y procesos finos cortos o largos), la expresión de transcripciones neuronales medidas a través de scRNA-Seq, así como la expresión de proteínas neuronales validadas mediante el etiquetado inmunofluorescente²⁷.

Aquí, el protocolo detalla cómo cultivar y transfectar MG a partir de ratones P12 adaptados del trabajo anterior 21,24,27. Elegido para este protocolo es el mencionado miRNA miR-25, un miRNA altamente expresado en RPCs, con bajos niveles de expresión en MG o neuronas retinianas. Para sobreexpresar miR-25, se utilizan imitaciones murinas de miR-25, es decir, moléculas artificiales de miRNA. Como control, se eligen imitaciones de un miRNA de Caenorhabditis elegans, que no tienen función en células de mamíferos. La visualización de la conversión de MG en RPC se realizó a través del ratón reportero RPC (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl), un ratón con fondo mixto (cepas C57BL/6, S129 e ICR). Sin embargo, este cultivo se puede realizar con todas las cepas de ratón, incluidas las cepas de tipo salvaje. En los últimos años, el protocolo original se ha modificado para reducir la duración de la fase de crecimiento y el período de cultivo general y garantizar un estado de células de la glía más robusto y minimizar el grado de degeneración celular, que ocurre en períodos de cultivo prolongados. La ventana de tiempo de transfección regular también se amplió de 3 h a 2 días. Como se mencionó anteriormente, aunque el protocolo actual describe los cultivos de MG como una herramienta para estudios de regeneración, el método no solo es útil para probar factores de reprogramación, sino que también se puede adaptar para otras aplicaciones, incluidos estudios sobre el comportamiento migratorio o proliferativo de MG, paradigmas relacionados con lesiones / daño celular y / o la identificación de mecanismos y vías subyacentes.

Protocol

Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en SUNY College of Optometry. NOTA: Este protocolo de cultivo consta de tres fases: crecimiento, transfección y fase de conversión. En la Figura 1 se ofrece un resumen del protocolo general con la línea de tiempo. 1. Preparación de medios y todos los reactivos requeridos <p class=…

Representative Results

Este protocolo describe cómo cultivar MG a partir de retinas de ratón P12 y cómo reprogramar estas células con miR-25 en neuronas retinianas utilizando el ratón reportero Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Este método fue utilizado en trabajos previos reportando en detalle otros miRNAs adecuados (imitadores o inhibidores, como moléculas individuales o en combinación) para reprogramar MG en RPC que luego adoptan características celulares neuronales27. Este m?…

Discussion

Este protocolo describe cómo cultivar MG a partir de retinas de ratón disociadas para estudios de reprogramación utilizando miRNAs. Como se muestra y confirma en una variedad de estudios previos, la gran mayoría (80%-90%) de las células encontradas en estos cultivos son MG 20,23,24. Este método es una técnica muy robusta y fiable y los resultados se pueden reproducir fácilmente si se sigue correctamente el protocolo<sup …

Materials

Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J	Jax laboratories	#012882	Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	Jax laboratories	#007914	Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer	Sigma-Aldrich	H7904-5MG	reconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution	VWR	100504-782	2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-546-152	dilution 1:500
Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	705-606-147	dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems	Fisher Scientific	AF1979	dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M9942-200UL	dilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody	Antibodies-Online	ABIN334653	dilution 1:500
Ascorbic Acid	STEMCELL Technologies	72132	reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 Supplement	Fisher Scientific	17-504-044	frozen aliquots
Brain Phys Neuronal Medium	STEMCELL Technologies	05790	used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit	Fisher Scientific	C10340	reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMP	STEMCELL Technologies	73886	reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	MT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35010CV	frozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement	Fisher Scientific	51-985-034	store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Fisher Scientific	12-605-028	used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSS	Fisher Scientific	14-025-134	store at 4 °C
Laminin mouse protein, natural	Fisher Scientific	23-017-015	frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.164323 1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
L-Glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control	Horizon	CN-001000-01-50	reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic	Horizon	C-310564-05-0050	reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 Supplement	Fisher Scientific	17-502-048	frozen aliquots
Neurobasal Medium	Fisher Scientific	21-103-049	used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical	LK003153	reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific	15-140-122	frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P4538-50MG	reconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF Protein	R&D Systems	248-BDB-050/CF	reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF Protein	Fisher Scientific	2028EG200	reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF Protein	Fisher Scientific	512GF010	reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	712-296-150	dilution 1:1,000
Slide Mounting Medium	Fisher Scientific	OB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)	Fisher Scientific	L3000015	store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)	Eppendorf	2231300008
Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12	Fisher Scientific	08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24	Fisher Scientific	08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets	Fisher Scientific	13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets	Fisher Scientific	13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets	Fisher Scientific	13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam Gloves	Fisher Scientific	19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness)	Fisher Scientific	22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm	Fisher Scientific	09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinet	Thermo Scientific	1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810	Keyence	9011800000
Binocular Zoom Stereo Microscope	Vision Scientific	VS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)	VWR	25384-088
Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium	Fine Science Tools	11252-40
Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox	Fine Science Tools	11255-20
Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium	Fine Science Tools	11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 R	Eppendorf	2231000508
Fine Scissors-sharp	Fine Science Tools	14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cm	World Precision Instruments	14124
Metal bead bath	Lab Armor	74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm	VWR	82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)	Living Systems Instrumentation	DD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5	World Precision Instruments	501979
Water Jacketed CO2 Incubator	VWR	10810-744