Confronto diretto tra lo scattering Raman stimolato iperspettrale e la microscopia a dispersione raman coerente anti-Stokes per l'imaging chimico

Summary

Questo documento confronta direttamente la risoluzione, la sensibilità e i contrasti di imaging dello scattering Raman stimolato (SRS) e dello scattering Raman anti-Stokes coerente (CARS) integrati nella stessa piattaforma del microscopio. I risultati mostrano che CARS ha una migliore risoluzione spaziale, SRS offre migliori contrasti e risoluzione spettrale ed entrambi i metodi hanno una sensibilità simile.

Abstract

Lo scattering Raman stimolato (SRS) e la microscopia a dispersione Raman (CARS) coerente anti-Stokes sono le tecnologie di imaging a dispersione Raman coerente più utilizzate. L’imaging iperspettrale SRS e CARS offre informazioni spettrali Raman su ogni pixel, che consente una migliore separazione di diverse composizioni chimiche. Sebbene entrambe le tecniche richiedano due laser di eccitazione, i loro schemi di rilevamento del segnale e le proprietà spettrali sono molto diversi. L’obiettivo di questo protocollo è quello di eseguire sia l’imaging iperspettrale SRS che CARS su un’unica piattaforma e confrontare le due tecniche di microscopia per l’imaging di diversi campioni biologici. Il metodo di messa a fuoco spettrale viene impiegato per acquisire informazioni spettrali utilizzando laser a femtosecondi. Utilizzando campioni chimici standard, vengono confrontate la sensibilità, la risoluzione spaziale e la risoluzione spettrale di SRS e CARS nelle stesse condizioni di eccitazione (ad esempio, potenza al campione, tempo di permanenza dei pixel, obiettivo, energia dell’impulso). I contrasti di imaging di CARS e SRS per campioni biologici sono giustapposti e confrontati. Il confronto diretto delle prestazioni di CARS e SRS consentirebbe una selezione ottimale della modalità per l’imaging chimico.

Introduction

Il fenomeno dello scattering Raman fu osservato per la prima volta nel 1928 da C. V. Raman¹. Quando un fotone incidente interagisce con un campione, può verificarsi spontaneamente un evento di scattering anelastico, in cui il cambiamento di energia del fotone corrisponde a una transizione vibrazionale delle specie chimiche analizzate. Questo processo non richiede l’uso di un tag chimico, rendendolo uno strumento versatile e privo di etichette per l’analisi chimica riducendo al minimo le perturbazioni del campione. Nonostante i suoi vantaggi, lo scattering Raman spontaneo soffre di una bassa sezione trasversale di scattering (tipicamente 10¹¹ inferiore alla sezione trasversale di assorbimento a infrarossi [IR]), che richiede lunghi tempi di acquisizione per l’analisi². Pertanto, la ricerca di aumentare la sensibilità del processo di scattering Raman è essenziale per spingere le tecnologie Raman per l’imaging in tempo reale.

Un modo efficace per migliorare notevolmente la sensibilità dello scattering Raman è attraverso processi di scattering Raman coerenti (CRS), per i quali due impulsi laser sono tipicamente utilizzati per eccitare le transizioni vibrazionali molecolari ^3,4. Quando la differenza di energia fotonica tra i due laser corrisponde alle modalità vibrazionali delle molecole campione, verranno generati forti segnali Raman. I due processi CRS più comunemente usati per l’imaging sono lo scattering raman anti-Stokes coerente (CARS) e lo scattering Raman stimolato (SRS)⁵. Negli ultimi due decenni, gli sviluppi tecnologici hanno avanzato le tecniche di microscopia CARS e SRS per diventare potenti strumenti per la quantificazione senza etichette e la delucidazione dei cambiamenti chimici nei campioni biologici.

L’imaging chimico mediante microscopia CARS può essere datato al 1982, quando la scansione laser è stata applicata per la prima volta per acquisire immagini CARS, dimostrata da Duncan et al⁶. La modernizzazione della microscopia CARS è stata notevolmente accelerata dopo le ampie applicazioni della microscopia a fluorescenza multifotone a scansione laser⁷. I primi lavori del gruppo Xie che utilizzano laser ad alto tasso di ripetizione hanno trasformato CARS in una piattaforma di imaging chimico ad alta velocità, priva di etichette, per la caratterizzazione di molecole in campioni biologici ^8,9,10. Uno dei principali problemi per l’imaging CARS è la presenza di uno sfondo non consonante, che riduce il contrasto dell’immagine e distorce lo spettro Raman. Sono stati fatti molti sforzi per ridurre lo sfondo non consonante 11,12,13,14,15 o per estrarre segnali Raman risonanti dagli spettri CARS ^16,17. Un altro progresso che ha notevolmente migliorato il campo è l’imaging CARS iperspettrale, che consente la mappatura spettrale di ogni pixel dell’immagine con una migliore selettività chimica 18,19,20,21.

Lo scattering Raman stimolato (SRS) è una tecnologia di imaging più giovane di CARS, sebbene sia stata scoperta prima del²². Nel 2007, la microscopia SRS è stata segnalata utilizzando una sorgente laser a basso tasso di ripetizione²³. Ben presto, diversi gruppi hanno dimostrato l’imaging SRS ad alta velocità utilizzando laser ad alto tasso di ripetizione 24,25,26. Uno dei principali vantaggi della microscopia SRS rispetto a CARS è l’assenza dello sfondo non consonante²⁷, sebbene altri sfondi come la modulazione multifase (XPM), l’assorbimento transitorio (TA), l’assorbimento a due fotoni (TPA) e l’effetto fototermico (PT), possano verificarsi con SRS²⁸. Inoltre, il segnale SRS e la concentrazione del campione hanno relazioni lineari, a differenza di CARS, che ha una dipendenza quadratica segnale-concentrazione²⁹. Ciò semplifica la quantificazione chimica e l’unmixing spettrale. L’SRS multicolore e iperspettrale si è evoluto in diverse forme ^{30,31,32,33,34,35,36}, con la messa a fuoco spettrale che è uno degli approcci più popolari per l’imaging chimico ^37,38.

Sia CARS che SRS richiedono la messa a fuoco della pompa e dei raggi laser Stokes sul campione per abbinare la transizione vibrazionale delle molecole per l’eccitazione del segnale. Anche i microscopi CARS e SRS hanno molto in comune. Tuttavia, la fisica alla base di questi due processi e le rilevazioni di segnali coinvolte in queste tecnologie di microscopia hanno disparità ^3,39. CARS è un processo parametrico che non ha un accoppiamento netto di energia fotone-molecola³. SRS, tuttavia, è un processo non parametrico e contribuisce al trasferimento di energia tra fotoni e sistemi molecolari²⁷. In CARS, viene generato un nuovo segnale alla frequenza anti-Stokes, mentre SRS si manifesta come il trasferimento di energia tra la pompa e i raggi laser Stokes.

Il segnale CARS soddisfa Eq (1)²⁸.

(1)

Nel frattempo, il segnale SRS può essere scritto come Eq (2)²⁸.

(2)

Qui, I_p, I_s, I_CARS e ΔI_SRS sono rispettivamente le intensità del fascio della pompa, del fascio di Stokes, del segnale CARS e dei segnali SRS. χ⁽³⁾ è la suscettibilità ottica non lineare del terzo ordine del campione ed è un valore complesso composto da parti reali e immaginarie.

Queste equazioni esprimono i profili spettrali e la dipendenza dalla concentrazione del segnale di CARS e SRS. Le differenze nella fisica si traducono in schemi di rilevamento disparati per queste due tecnologie di microscopia. Il rilevamento del segnale in CARS di solito comporta la separazione spettrale di fotoni di nuova generazione e il rilevamento utilizzando un tubo fotomoltiplicatore (PMT) o un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD); per SRS, lo scambio di energia tra la pompa e i fasci di Stokes viene solitamente misurato mediante modulazione di intensità ad alta velocità utilizzando un modulatore ottico e demodulazione utilizzando un fotodiodo (PD) abbinato a un amplificatore lock-in.

Sebbene molti sviluppi tecnologici e applicazioni siano stati pubblicati negli ultimi anni sia in ambito CARS che SRS, non sono stati eseguiti confronti sistematici delle due tecniche CRS sulla stessa piattaforma, in particolare per la microscopia iperspettrale CARS e SRS. Confronti diretti in sensibilità, risoluzione spaziale, risoluzione spettrale e capacità di separazione chimica consentirebbero ai biologi di selezionare la migliore modalità per la quantificazione chimica. In questo protocollo, vengono forniti passaggi dettagliati per costruire una piattaforma di imaging multimodale con entrambe le modalità CARS iperspettrale e SRS basate su un sistema laser a femtosecondi e messa a fuoco spettrale. Le due tecniche sono state confrontate in avanti per la risoluzione spettrale, la sensibilità di rilevamento, la risoluzione spaziale e i contrasti di imaging delle cellule.

Protocol

1. Configurazione strumentale per l’imaging CRS iperspettrale NOTA: La generazione del segnale CRS richiede l’uso di laser ad alta potenza (ad esempio, classe 3B o classe 4). I protocolli di sicurezza devono essere affrontati e devono essere indossati in ogni momento adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) quando si lavora a potenze di picco così elevate. Consultare la documentazione appropriata prima della sperimentazione. Questo protocollo si concentra sulla prog…

Representative Results

Confronti della risoluzione spettraleLa Figura 2 confronta la risoluzione spettrale della microscopia iperspettrale SRS (Figura 2A) e CARS (Figura 2B) utilizzando un campione DMSO. Per lo spettro SRS, sono state applicate due funzioni lorentziane (vedi fase di protocollo 2.3) per adattarsi allo spettro e una risoluzione di 14,6 cm-1 è stata ottenuta utilizzando il picco di 2.913 cm-1 . Per…

Discussion

Il protocollo qui presentato descrive la costruzione di un microscopio CRS multimodale e il confronto diretto tra CARS e SRS imaging. Per la costruzione del microscopio, i passaggi critici sono la sovrapposizione del fascio spaziale e temporale e l’ottimizzazione delle dimensioni del fascio. Si consiglia di utilizzare un campione standard come DMSO prima dell’imaging biologico per ottimizzare l’SNR e calibrare gli spostamenti Raman. Il confronto diretto tra le immagini CARS e SRS rivela che CARS ha una migliore risoluzio…

Materials

2D galvo scanner set	Thorlabs	GVS002
Acousto-optic modulator	Isomet	M1205-P80L-0.5
AOM driver	Isomet	532B-2
Data acquisition card	National Instruments	PCle 6363	Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage	Zaber	X-LSM050A
Deuterium oxide	Millipore Sigma	151882-100G
Dichroic mirror for beam combination	Thorlabs	DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation	Semrock	FF776-Di01-25×36
DMSO	MiliporeSigma	200-664-3
MIA PaCa 2 Cells	ATCC	CRL-1420
Femtosecond laser system	Spectral Physics	InSightX3+
Filter for CARS	Chroma	AT655/30m
Filter for SRS	Chroma	ET980sp
Function generator	Rigol	DG1022Z
Glass rods	Lattice Electro Optics	SF-57
Half-wave plate	Newport	10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020	National Instruments		This is the image acquisition software
Lock-in amplifier	Zurich Instrument	HF2LI
Microscope housing	Olympus	BX51W1
Objective lens	Olympus	UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b	OriginLab Corporation		This is the spectral fitting software
Oscilloscope	Tektronix	TBS2204B
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01
PMT detector	Hamamatsu	H7422P-40
PMT voltage amplifier	Advanced Research Instrument Corp.	PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube	Thorlabs	PBS255
Terminal block	National Instruments	BNC-2110