Comparação direta da dispersão de Raman estimulada hiperespectral e microscopia de dispersão de Raman coerente para imagem química

Summary

Este artigo compara diretamente os contrastes de resolução, sensibilidade e imagem da dispersão estimulada de Raman (SRS) e da dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) integrada à mesma plataforma de microscópio. Os resultados mostram que o CARS tem uma melhor resolução espacial, o SRS dá melhores contrastes e resolução espectral, e ambos os métodos têm sensibilidade semelhante.

Abstract

A dispersão estimulada de Raman (SRS) e a microscopia de dispersão anti-Stokes Raman (CARS) são as tecnologias de imagem de dispersão raman mais amplamente utilizadas. As imagens hiperespectrais SRS e CARS oferecem informações espectrais de Raman a cada pixel, o que permite uma melhor separação de diferentes composições químicas. Embora ambas as técnicas exijam dois lasers de excitação, seus esquemas de detecção de sinal e propriedades espectrais são bem diferentes. O objetivo deste protocolo é realizar imagens de SRS hiperespectrais e CARS em uma única plataforma e comparar as duas técnicas de microscopia para imagens de diferentes amostras biológicas. O método de foco espectral é empregado para adquirir informações espectrais usando lasers femtosegundos. Utilizando amostras químicas padrão, a sensibilidade, resolução espacial e resolução espectral de SRS e CARS nas mesmas condições de excitação (ou seja, energia na amostra, tempo de moradia dos pixels, lente objetiva, energia de pulso) são comparadas. Os contrastes de imagem de CARROS e SRS para amostras biológicas são justtaposed e comparados. A comparação direta dos desempenhos de CARROS e SRS permitiria a seleção ideal da modalidade para imagem química.

Introduction

O fenômeno de dispersão de Raman foi observado pela primeira vez em 1928 por C. V. Raman¹. Quando um fóton incidente está interagindo com uma amostra, um evento de dispersão inelástica pode ocorrer espontaneamente, no qual a mudança de energia do fóton corresponde a uma transição vibracional das espécies químicas analisadas. Este processo não requer o uso de uma etiqueta química, tornando-a uma ferramenta versátil e livre de rótulos para análise química, minimizando a perturbação da amostra. Apesar de suas vantagens, a dispersão espontânea de Raman sofre de uma seção transversal de baixa dispersão (tipicamente 10¹¹ menor que a seção transversal de absorção infravermelha [IR]), o que requer longos tempos de aquisição para análise². Assim, a busca pelo aumento da sensibilidade do processo de dispersão de Raman é essencial para impulsionar as tecnologias Raman para imagens em tempo real.

Uma maneira eficaz de aumentar muito a sensibilidade da dispersão de Raman é através de processos coerentes de dispersão de Raman (CRS), para os quais dois pulsos de laser são tipicamente usados para excitar transições vibracionais moleculares ^3,4. Quando a diferença de energia de fótons entre os dois lasers corresponde aos modos vibracionais das moléculas de amostra, fortes sinais raman serão gerados. Os dois processos de CRS mais usados para imagem são a dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) e a dispersão de Raman estimulada (SRS)⁵. Nas últimas duas décadas, os desenvolvimentos tecnológicos avançaram nas técnicas de microscopia de CARROS e SRS para se tornarem ferramentas poderosas para quantificação sem rótulos e elucidação de alterações químicas em amostras biológicas.

A imagem química por microscopia CARS pode ser datada de 1982 quando a varredura a laser foi aplicada pela primeira vez para adquirir imagens CARS, demonstradas por Duncan et al⁶. A modernização da microscopia CARS foi bastante acelerada após as amplas aplicações da microscopia de fluorescência multifoton^{a laser 7}. Os primeiros trabalhos do grupo Xie usando lasers de alta taxa de repetição tornaram-se uma plataforma de imagem química de alta velocidade, sem rótulos, para a caracterização de moléculas em amostras biológicas ^8,9,10. Um dos principais problemas para a imagem cars é a presença de um fundo não ressonante, que reduz o contraste da imagem e distorce o espectro Raman. Muitos esforços foram feitos para reduzir o fundo não ressonante 11,12,13,14,15 ou para extrair sinais raman ressonantes do espectro ^{CARS 16,17}. Outro avanço que tem avançado muito o campo é a imagem de CARS hiperespectral, que permite o mapeamento espectral em cada pixel de imagem com melhor seletividade química 18,19,20,21.

A dispersão de Raman Estimulada (SRS) é uma tecnologia de imagem mais jovem do que cars, embora tenha sido descoberta anteriormente^{aos 22 anos}. Em 2007, a microscopia SRS foi relatada usando uma baixa taxa de repetição da fonte laser²³. Logo, vários grupos demonstraram imagens de SRS de alta velocidade usando lasers de alta taxa de repetição 24,25,26. Uma das principais vantagens da microscopia SRS sobre carros é a ausência do fundo não ressonante²⁷, embora outros fundos como modulação transversal (XPM), absorção transitória (TA), absorção de dois fótons (TPA) e efeito fototermal (PT), possam ocorrer com o SRS²⁸. Além disso, o sinal SRS e a concentração amostral têm relações lineares, ao contrário dos CARS, que tem uma dependência quadrática de concentração de sinal²⁹. Isso simplifica a quantificação química e o descompramento espectral. A SRS multicolorida e hiperespectral evoluiu de diferentes formas 30,31,32,33,34,35,36, com foco espectral sendo uma das abordagens mais populares para a imagem química ^37,38.

Tanto os CARROS quanto o SRS requerem o foco da bomba e os raios laser de Stokes na amostra para combinar com a transição vibracional das moléculas para excitação de sinal. Os microscópios CARS e SRS também compartilham muito em comum. No entanto, a física subjacente a esses dois processos, e as detecções de sinais envolvidas nessas tecnologias de microscopia têm disparidades ^3,39. CARS é um processo paramétrico que não tem acoplamento de energia net fóton-molécula³. O SRS, no entanto, é um processo não paramétrico, e contribui para a transferência de energia entre fótons e sistemas moleculares²⁷. Em CARS, um novo sinal na frequência anti-Stokes é gerado, enquanto o SRS se manifesta como a transferência de energia entre a bomba e os raios laser stokes.

O sinal CARS satisfaz eq (1)²⁸.

(1)

Enquanto isso, o sinal SRS pode ser escrito como Eq (2)²⁸.

(2)

Aqui, eu_p, i_s, I_CARS, e ΔI_SRS são as intensidades do feixe de bomba, feixe de Stokes, sinal CARS e sinais SRS, respectivamente. Χ⁽³⁾ é a suscetibilidade óptica não linear de terceira ordem da amostra, e é um valor complexo composto de partes reais e imaginárias.

Essas equações expressam os perfis espectrais e a dependência de concentração de sinais de CARROS e SRS. Diferenças na física resultam em esquemas de detecção diferentes para essas duas tecnologias de microscopia. A detecção de sinal em CARROS geralmente envolve a separação espectral de fótons recém-gerados e a detecção usando um tubo fotomultiplier (PMT) ou dispositivo acoplado por carga (CCD); para SRS, a troca de energia entre a bomba e os feixes de Stokes é geralmente medida pela modulação de alta velocidade de intensidade usando um modulador óptico e desmodulação usando um fotodiodo (PD) emparelhado com um amplificador de travamento.

Embora muitos desenvolvimentos tecnológicos e aplicações tenham sido publicados nos últimos anos nos campos de CARROS e SRS, não foram realizadas comparações sistemáticas das duas técnicas de CRS na mesma plataforma, especialmente para carros hiperespectrais e microscopia SRS. Comparações diretas em sensibilidade, resolução espacial, resolução espectral e capacidades de separação química permitiriam aos biólogos selecionar a melhor modalidade de quantificação química. Neste protocolo, são fornecidas etapas detalhadas para a construção de uma plataforma de imagem multimodal com as modalidades CARROS hiperespectrais e SRS baseadas em um sistema laser femtosegundo e foco espectral. As duas técnicas foram comparadas na direção para resolução espectral, sensibilidade à detecção, resolução espacial e contrastes de imagem das células.

Protocol

1. Configuração instrumental para imagens de CRS hiperespectrais NOTA: A geração de sinal CRS requer o uso de lasers de alta potência (ou seja, classe 3B ou classe 4). Os protocolos de segurança devem ser abordados e os equipamentos de proteção individual (EPI) adequados devem ser usados em todos os momentos quando se trabalha em potências de pico tão altas. Consulte a documentação adequada antes da experimentação. Este protocolo se concentra em projetar o caminho …

Representative Results

Comparações da resolução espectralA Figura 2 compara a resolução espectral da microscopia hiperespectral SRS (Figura 2A) e CARS (Figura 2B) utilizando uma amostra de DMSO. Para o espectro SRS, duas funções lorentzianas (ver protocolo passo 2.3) foram aplicadas para se adequar ao espectro, e uma resolução de 14,6 cm-1 foi obtida utilizando-se o pico de 2.913 cm-1 . Para carros, foi…

Discussion

O protocolo aqui apresentado descreve a construção de um microscópio CRS multimodal e a comparação direta entre carros e imagens SRS. Para a construção do microscópio, as etapas críticas são a sobreposição do feixe espacial e temporal e a otimização do tamanho do feixe. Recomenda-se o uso de uma amostra padrão como o DMSO antes da imagem biológica para otimizar o SNR e calibrar as mudanças de Raman. A comparação direta entre as imagens cars e srs revela que o CARS tem uma melhor resolução espacial, e…

Materials

2D galvo scanner set	Thorlabs	GVS002
Acousto-optic modulator	Isomet	M1205-P80L-0.5
AOM driver	Isomet	532B-2
Data acquisition card	National Instruments	PCle 6363	Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage	Zaber	X-LSM050A
Deuterium oxide	Millipore Sigma	151882-100G
Dichroic mirror for beam combination	Thorlabs	DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation	Semrock	FF776-Di01-25×36
DMSO	MiliporeSigma	200-664-3
MIA PaCa 2 Cells	ATCC	CRL-1420
Femtosecond laser system	Spectral Physics	InSightX3+
Filter for CARS	Chroma	AT655/30m
Filter for SRS	Chroma	ET980sp
Function generator	Rigol	DG1022Z
Glass rods	Lattice Electro Optics	SF-57
Half-wave plate	Newport	10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020	National Instruments		This is the image acquisition software
Lock-in amplifier	Zurich Instrument	HF2LI
Microscope housing	Olympus	BX51W1
Objective lens	Olympus	UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b	OriginLab Corporation		This is the spectral fitting software
Oscilloscope	Tektronix	TBS2204B
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01
PMT detector	Hamamatsu	H7422P-40
PMT voltage amplifier	Advanced Research Instrument Corp.	PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube	Thorlabs	PBS255
Terminal block	National Instruments	BNC-2110