Summary

Provocando a interação entre células assassinas naturais e neurônios nociceptores

Published: June 30, 2022
doi:

Summary

Os neurônios nociceptores e as células NK interagem ativamente em um contexto inflamatório. Uma abordagem de co-cultura permite estudar essa interação.

Abstract

Os neurônios somatossensoriais evoluíram para detectar estímulos nocivos e ativar reflexos defensivos. Ao compartilhar meios de comunicação, os neurônios nociceptores também ajustam as defesas do hospedeiro, controlando a atividade do sistema imunológico. A comunicação entre esses sistemas é principalmente adaptativa, ajudando a proteger a homeostase, também pode levar a, ou promover, o aparecimento de doenças crônicas. Ambos os sistemas co-evoluíram para permitir essa interação local, como encontrado nos tecidos linfoides primários e secundários e na mucosa. Estudos recentes demonstraram que os nociceptores detectam e respondem diretamente a antígenos estranhos, citocinas derivadas de células imunes e micróbios.

A ativação do nociceptor não só resulta em hipersensibilidade à dor e coceira, mas reduz o limiar de disparo do nociceptor, levando à liberação local de neuropeptídeos. Os peptídeos que são produzidos e liberados a partir dos terminais periféricos dos nociceptores podem bloquear a quimiotaxia e a polarização dos linfócitos, controlando a localização, a duração e o tipo de inflamação. Evidências recentes mostram que os neurônios sensoriais interagem com células imunes inatas através do contato célula-célula, por exemplo, envolvendo receptores de grupo 2D (NKG2D) em células natural killer (NK).

Dado que as células NK expressam os receptores cognatos para vários mediadores produzidos por nociceptores, é concebível que os nociceptores usem neuropeptídeos para controlar a atividade das células NK. Aqui, elaboramos um método de co-cultura para estudar as interações entre o neurônio nociceptor e as células NK em um prato. Usando essa abordagem, descobrimos que os neurônios nociceptores lombares diminuem a expressão de citocinas de células NK. No geral, esse método reducionista poderia ser útil para estudar como os neurônios inervantes de tumores controlam a função anticancerígena das células NK e como as células NK controlam a eliminação de neurônios lesionados.

Introduction

Os corpos celulares dos neurônios sensoriais se originam nos gânglios da raiz dorsal (DRG). Os DRG estão localizados no sistema nervoso periférico (SNP), entre o corno dorsal da medula espinhal e os terminais nervosos periféricos. A natureza pseudo-unipolar dos neurônios DRG permite a transferência de informações do ramo periférico, que inerva o tecido alvo, para o ramo central, que transporta a informação somatossensorial para a medula espinhal1. Usando receptores de canais iônicos especializados, os neurônios de primeira ordem detectam ameaças representadas por patógenos, alérgenos e poluentes2, levando ao influxo de cátions (Na+, Ca2+) e à geração de um potencial de ação 3,4,5.

Esses neurônios também enviam potencial de ação antidrômica para a periferia, onde ocorreu a detecção inicial de perigo, o que leva à liberação local de neuropeptídeos 1,4. Portanto, os neurônios nociceptores servem como mecanismo de proteção, alertando o hospedeiro para o perigo ambiental 4,5,6,7.

Para se comunicar com neurônios de segunda ordem, os nociceptores liberam vários neurotransmissores (por exemplo, glutamato) e neuropeptídeos (por exemplo, peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), substância P (SP) e peptídeo intestinal vasoativo (VIP)))6,7. Esses peptídeos atuam sobre os capilares e promovem extravasamento plasmático, edema e influxo e modulação locais de células imunes 2,4,7.

Os sistemas somatossensorial e imunológico utilizam um sistema de comunicação compartilhado composto por citocinas e neuropeptídeos, e seus respectivos receptores cognatos4. Embora essa comunicação bidirecional ajude a proteger do perigo e preservar a homeostase, também pode contribuir para a fisiopatologia da doença4.

As células NK são classificadas como células linfoides inatas e são especializadas para eliminar células infectadas por vírus. A função das células NK é governada por um equilíbrio de receptores estimulatórios e inibitórios, incluindo o receptor ativador NKG2D8. O ligante endógeno do NKG2D, ácido retinóico induzível precoce1 (RAE1), é expresso por células submetidas a estresse, como tumorigênese e infecção 8,9.

Investigações recentes mostraram que a lesão do nervo periférico leva os neurônios sensoriais a expressar moléculas desadaptativas, como a estatina 2 (STMN2) e a RAE1. Assim, através do contato célula-célula, as células NK que expressam NKG2D foram ativadas pela interação com neurônios que expressam RAE1. Por sua vez, as células NK foram capazes de eliminar neurônios nociceptores lesados e hipersensibilidade à dor contusa normalmente associada à lesão nervosa10. Além do eixo NKG2D-RAE1, as células NK expressam os receptores cognatos para vários mediadores produzidos por nociceptores. Portanto, é possível que esses mediadores modulem a atividade das células NK. Este trabalho apresenta um método de co-cultura para investigar a biologia da interação nociceptor neurônio-célula NK. Essa abordagem ajudará a avançar a compreensão de como os neurônios nociceptores modulam as respostas inatas das células imunes a lesões, infecções ou malignidades.

Protocol

Os Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Université de Montréal (#22053, #22054) aprovaram todos os procedimentos para animais. Consulte a Tabela 1 para uma lista de soluções e sua composição e a Tabela de Materiais para uma lista de materiais, equipamentos e reagentes usados neste protocolo. 1. Isolamento, cultura e estimulação de células NK Gerar neurônio nociceptor intacto (controle de companheiro de ni…

Representative Results

As células NK foram purificadas magneticamente a partir de esplenócitos de camundongos controle de ninhada (TRPV1 wt::D TAfl/wt) e estimuladas (48 h) com IL-2 e IL-15. As células NK foram então cultivadas isoladamente ou co-cultivadas com neurônios DRG colhidos do neurônio nociceptor intacto (controle littermate; TRPV1wt: :D TA fl/wt) ou ratos ablados (TRPV1cre::D TAfl/wt). As células foram então expostas ao agonista TRPV1 capsaicina (1 μM) ou seu…

Discussion

Davies et al.11 encontraram que os neurônios lesados regulam positivamente a RAE1. Através do contato célula-célula, as células NK que expressam NKG2D foram então capazes de identificar e eliminar neurônios RAE1+ , que por sua vez limitam a dor crônica11. Dado que as células NK também expressam vários receptores neuropeptídicos, e que esses neuropeptídeos são conhecidos por suas capacidades imunomoduladoras, parece cada vez mais importante …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (162211, 461274, 461275), pela Fundação Canadense para a Inovação (37439), pelo programa Canada Research Chair (950-231859), pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (RGPIN-2019-06824) e pelo Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).

Materials

Anti-mouse CD16/32 Jackson Laboratory Cat no: 017769
B-27 Jackson Laboratory Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade World Precision Instruments Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1 Fisher Scientific Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm) Fisher Scientific Cat no: A3160702
Collagenase IV Fisher Scientific Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl Fisher Scientific Cat no: SH3057402
Dispase II Fisher Scientific Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit Sigma Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Cat no: C0130
FACSAria III Sigma Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS) Sigma Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46 Sigma Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate Sigma Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette Sigma Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) VWR Cat no: 02-0131
Laminin Cedarlane Cat no: 03-50/31
L-Glutamine Gibco Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15 Gibco Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2 Gibco Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF) Life Technologies Cat no: 13257-019
Neurobasal media PeproTech Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF PeproTech Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin PeproTech Cat no: 210-15
Pestles Stem Cell Technology Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS) Biolegend Cat no: 108732 Clone PK136
RPMI 1640 media Biolegend Cat no: 137606 Clone 29A1.4
TRPV1Cre Biolegend Cat no: 505406 Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools. Biolegend Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate Biolegend Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780 Becton Dickinson

References

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Cite This Article
Ahmadi, A., Balood, M., Roversi, K., Ahmadi, M., Rafei, M., Talbot, S. Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons. J. Vis. Exp. (184), e63800, doi:10.3791/63800 (2022).

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