Summary

Поддразнивание взаимодействия между естественными клетками-киллерами и нейронами ноцицепторов

Published: June 30, 2022
doi:

Summary

Ноцицепторные нейроны и NK-клетки активно взаимодействуют в воспалительном контексте. Кокультурный подход позволяет изучать это взаимодействие.

Abstract

Соматосенсорные нейроны эволюционировали для обнаружения вредных раздражителей и активации защитных рефлексов. Разделяя средства связи, ноцицепторные нейроны также настраивают защиту хозяина, контролируя активность иммунной системы. Связь между этими системами в основном адаптивная, помогая защитить гомеостаз, она также может привести или способствовать возникновению хронических заболеваний. Обе системы совместно эволюционировали, чтобы обеспечить такое локальное взаимодействие, как в первичных и вторичных лимфоидных тканях и слизистой оболочке. Недавние исследования показали, что ноцицепторы непосредственно обнаруживают и реагируют на чужеродные антигены, цитокины, полученные из иммунных клеток, и микробы.

Активация ноцицепторов не только приводит к гиперчувствительности к боли и зуду, но и снижает порог срабатывания ноцицепторов, что приводит к локальному высвобождению нейропептидов. Пептиды, которые вырабатываются периферическими терминалами ноцицепторов и высвобождаются из них, могут блокировать хемотаксис и поляризацию лимфоцитов, контролируя локализацию, продолжительность и тип воспаления. Последние данные показывают, что сенсорные нейроны взаимодействуют с врожденными иммунными клетками через клеточный контакт, например, привлекая рецепторы группы 2D (NKG2D) на клетках-естественных киллерах (NK).

Учитывая, что NK-клетки экспрессируют родственные рецепторы для различных медиаторов, продуцируемых ноцицепторами, вполне возможно, что ноцицепторы используют нейропептиды для контроля активности NK-клеток. Здесь мы разрабатываем метод кокультуры для изучения взаимодействия ноцицепторных нейронов и NK-клеток в чашке. Используя этот подход, мы обнаружили, что поясничные ноцицепторные нейроны уменьшают экспрессию цитокинов NK-клеток. В целом, такой редукционистский метод может быть полезен для изучения того, как иннервирующие опухоль нейроны контролируют противоопухолевую функцию NK-клеток и как NK-клетки контролируют устранение поврежденных нейронов.

Introduction

Клеточные тела сенсорных нейронов берут свое начало в дорсальных корневых ганглиях (ДРГ). ДРГ расположены в периферической нервной системе (ПНС), между дорсальным рогом спинного мозга и периферическими нервными окончаниями. Псевдоуниполярная природа нейронов ДРГ позволяет передавать информацию от периферической ветви, которая иннервирует ткань-мишень, к центральной ветви, которая несет соматосенсорную информацию к спинному мозгу1. Используя специализированные рецепторы ионных каналов, нейроны первого порядка ощущают угрозы, создаваемые патогенами, аллергенами и загрязняющими веществами2, что приводит к притоку катионов (Na+, Ca2+) и генерации потенциала действия 3,4,5.

Эти нейроны также посылают антидромный потенциал действия к периферии, где произошло первоначальное ощущение опасности, что приводит к локальному высвобождению нейропептидов 1,4. Поэтому нейроны ноцицептора служат защитным механизмом, предупреждая хозяина об экологической опасности 4,5,6,7.

Для связи с нейронами второго порядка ноцицепторы высвобождают различные нейротрансмиттеры (например, глутамат) и нейропептиды (например, пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), вещество P (SP) и вазоактивный кишечный пептид (VIP))6,7. Эти пептиды действуют на капилляры и способствуют экстравазации плазмы, отекам, а также местному притоку и модуляции иммунных клеток 2,4,7.

Соматосенсорная и иммунная системы используют общую систему связи, состоящую из цитокинов и нейропептидов, и их соответствующих родственных рецепторов4. Хотя эта двунаправленная связь помогает защитить от опасности и сохранить гомеостаз, она также может способствовать патофизиологии заболевания4.

NK-клетки классифицируются как врожденные лимфоидные клетки и специализируются на устранении вирусно инфицированных клеток. Функция NK-клеток регулируется балансом стимулирующих и тормозных рецепторов, включая активирующий рецептор NKG2D8. Эндогенный лиганд NKG2D, ранняя индуцируемая ретиноевая кислота1 (RAE1), экспрессируется клетками, подвергающимися стрессу, такому как опухолевый генез и инфекция 8,9.

Недавние исследования показали, что повреждение периферических нервов заставляет сенсорные нейроны экспрессировать дезадаптивные молекулы, такие как статмин 2 (STMN2) и RAE1. Таким образом, через клеточно-клеточный контакт NKG2D-экспрессирующие NK-клетки активировались взаимодействием с RAE1-экспрессирующими нейронами. В свою очередь, NK-клетки смогли устранить поврежденные нейроны ноцицептора и тупую болевую гиперчувствительность, обычно связанную с повреждением нерва10. В дополнение к оси NKG2D-RAE1, NK-клетки экспрессируют родственные рецепторы для различных медиаторов, продуцируемых ноцицепторами. Поэтому возможно, что эти медиаторы модулируют активность NK-клеток. В данной работе представлен метод кокультуры для исследования биологии взаимодействия нейрон-NK-клетка ноцицептора. Этот подход поможет продвинуть понимание того, как нейроны ноцицепторов модулируют врожденные иммунные клеточные реакции на травму, инфекцию или злокачественность.

Protocol

Институциональные комитеты по уходу за животными и их использованию Монреальского университета (#22053, #22054) одобрили все процедуры для животных. Список растворов и их состав см. в Таблице 1 , а в Таблице материалов — список материалов, оборудования и реагентов, используе…

Representative Results

NK-клетки были магнитно очищены от контрольных (TRPV1wt: :D TAfl / wt) спленоцитов мышей и стимулировали (48 ч) IL-2 и IL-15. Затем NK-клетки культивировали отдельно или совместно культивировали с нейронами DRG, собранными из неповрежденного ноцицепторного нейрона (контроль помета; TRPV1wt: …

Discussion

Davies et al.11 обнаружили, что поврежденные нейроны повышают регуляцию RAE1. Благодаря клеточно-клеточному контакту NKG2D-экспрессирующие NK-клетки смогли идентифицировать и устранить нейроны RAE1+ , которые, в свою очередь, ограничивают хроническую боль11. Учит?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Фондом новых рубежей в исследованиях (NFRFE201901326), Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (162211, 461274, 461275), Канадским фондом инноваций (37439), Канадской программой исследовательской кафедры (950-231859), Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (RGPIN-2019-06824) и Фондом исследований природы Квебека и технологий (253380).

Materials

Anti-mouse CD16/32 Jackson Laboratory Cat no: 017769
B-27 Jackson Laboratory Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade World Precision Instruments Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1 Fisher Scientific Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm) Fisher Scientific Cat no: A3160702
Collagenase IV Fisher Scientific Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl Fisher Scientific Cat no: SH3057402
Dispase II Fisher Scientific Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit Sigma Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Cat no: C0130
FACSAria III Sigma Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS) Sigma Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46 Sigma Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate Sigma Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette Sigma Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) VWR Cat no: 02-0131
Laminin Cedarlane Cat no: 03-50/31
L-Glutamine Gibco Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15 Gibco Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2 Gibco Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF) Life Technologies Cat no: 13257-019
Neurobasal media PeproTech Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF PeproTech Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin PeproTech Cat no: 210-15
Pestles Stem Cell Technology Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS) Biolegend Cat no: 108732 Clone PK136
RPMI 1640 media Biolegend Cat no: 137606 Clone 29A1.4
TRPV1Cre Biolegend Cat no: 505406 Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools. Biolegend Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate Biolegend Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780 Becton Dickinson

References

  1. Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
  2. Baral, P., et al. Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia. Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).
  3. Binshtok, A. M., et al. Nociceptors are interleukin-1beta sensors. Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).
  4. Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. Neuro-immune regulation of mucosal physiology. Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).
  5. Samad, T. A., et al. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).
  6. Godinho-Silva, C., et al. Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis. Nature. 574, 254-258 (2019).
  7. Talbot, J., et al. Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier. Nature. 579, 575-580 (2020).
  8. Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).
  9. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331, 44-49 (2011).
  10. Davies, A. J., et al. Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury. Cell. 176, 716-728 (2019).
  11. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2, 100333 (2021).
  12. Goswami, S. C., et al. Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis. Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).
  13. Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 30, 582-593 (2011).
  14. Kim, H. S., et al. Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism. Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).

Play Video

Cite This Article
Ahmadi, A., Balood, M., Roversi, K., Ahmadi, M., Rafei, M., Talbot, S. Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons. J. Vis. Exp. (184), e63800, doi:10.3791/63800 (2022).

View Video