Summary

נטרול יחסי הגומלין בין תאי הרג טבעיים לבין נוירונים של נוסיצפטורים

Published: June 30, 2022
doi:

Summary

נוירונים Nociceptor ותאי NK אינטראקציה פעילה בהקשר דלקתי. גישה של תרבות משותפת מאפשרת ללמוד את יחסי הגומלין האלה.

Abstract

נוירונים סומטוסנסוריים התפתחו כדי לזהות גירויים רעילים ולהפעיל רפלקסים הגנתיים. על ידי שיתוף אמצעי תקשורת, נוירונים nociceptor גם לכוון את הגנות המארח על ידי שליטה על הפעילות של המערכת החיסונית. התקשורת בין מערכות אלה היא בעיקר אדפטיבית, עוזר להגן על הומאוסטזיס, זה יכול גם להוביל, או לקדם, את הופעת מחלות כרוניות. שתי המערכות התפתחו יחד כדי לאפשר אינטראקציה מקומית כזו, כפי שנמצאת ברקמות לימפה ראשוניות ומשניות וברירית. מחקרים אחרונים הראו כי nociceptors מזהים ומגיבים ישירות לאנטיגנים זרים, ציטוקינים שמקורם בתאי מערכת החיסון ומיקרובים.

הפעלת Nociceptor לא רק גורמת לרגישות יתר לכאב וגירוד, אלא מורידה את סף ירי הנוציצפטור, מה שמוביל לשחרור מקומי של נוירופפטידים. הפפטידים המיוצרים על ידי, ומשוחררים, הטרמינלים ההיקפיים של nociceptors יכול לחסום את chemotaxis ואת הקיטוב של לימפוציטים, שליטה על לוקליזציה, משך, וסוג של דלקת. עדויות עדכניות מראות כי נוירונים תחושתיים מתקשרים עם תאי חיסון מולדים באמצעות מגע בין תאים, לדוגמה, תוך הפעלת קולטני דו-ממד מקבוצה (NKG2D) על תאי הרג טבעי (NK).

בהתחשב בכך שתאי NK מבטאים את הקולטנים הקוגנטיים עבור מתווכים שונים המיוצרים על ידי nociceptor, ניתן להעלות על הדעת כי nociceptors להשתמש נוירופפטידים כדי לשלוט על הפעילות של תאי NK. כאן, אנו מפתחים שיטת תרבית משותפת כדי לחקור אינטראקציות נוירון-NK של nociceptor בצלחת. באמצעות גישה זו, מצאנו כי נוירונים של nociceptor מותני מפחיתים את ביטוי הציטוקינים של תאי NK. באופן כללי, שיטה רדוקציוניסטית כזו יכולה להיות שימושית כדי לחקור כיצד נוירונים מעוררי גידול שולטים בתפקוד האנטי-סרטני של תאי NK, וכיצד תאי NK שולטים בחיסול תאי עצב פצועים.

Introduction

גופי התאים של נוירונים חושיים מקורם בגרעיני השורש הגבי (DRG). ה- DRG ממוקמים במערכת העצבים ההיקפית (PNS), בין הקרן הגבית של חוט השדרה לבין קצות העצבים ההיקפיים. האופי הפסאודו-חד קוטבי של נוירוני DRG מאפשר העברת מידע מהענף ההיקפי, אשר innervates את רקמת המטרה, אל הענף המרכזי, אשר נושא את המידע הסומטוסנסורי אל חוט השדרה1. באמצעות קולטני תעלות יונים מיוחדים, נוירונים מסדר ראשון חשים איומים הנשקפים מפתוגנים, אלרגנים ומזהמים2, מה שמוביל לזרם הקטיונים (Na+, Ca2+) וליצירת פוטנציאל פעולה 3,4,5.

תאי עצב אלה גם שולחים פוטנציאל פעולה אנטי-דרומי לכיוון הפריפריה, שם התרחשה חישת הסכנה הראשונית, מה שמוביל לשחרור מקומי של נוירופפטידים 1,4. לכן, נוירונים nociceptor לשמש מנגנון הגנה, התראה המארח על סכנה סביבתית 4,5,6,7.

כדי לתקשר עם נוירונים מסדר שני, הנוציצפטורים משחררים מוליכים עצביים שונים (למשל, גלוטמט) ונוירופפטידים (למשל, פפטיד הקשור לגנים קלציטונין (CGRP), חומר P (SP) ופפטיד מעיים vasoactive (VIP))6,7. פפטידים אלה פועלים על נימים ומקדמים אקסטרווזיה של פלזמה, בצקת, ואת הזרימה והמודולציה המקומית של תאי מערכת החיסון 2,4,7.

המערכת הסומטוסנסורית ומערכת החיסון משתמשות במערכת תקשורת משותפת המורכבת מציטוקינים ונוירופפטידים, והקולטנים הקוגנטיים שלהם4. בעוד שתקשורת דו-כיוונית זו מסייעת בהגנה מפני סכנה ובשימור הומאוסטזיס, היא יכולה גם לתרום לפתופיזיולוגיה של מחלות4.

תאי NK מסווגים כתאי לימפה מולדים והם מתמחים בחיסול תאים נגועים ויראליים. תפקוד תאי NK נשלט על ידי איזון של קולטנים מגרים ומעכבים, כולל הקולטן המפעיל NKG2D8. הליגנד האנדוגני של NKG2D, חומצה רטינואית מוקדמת1 (RAE1), מתבטא בתאים העוברים עקה כגון גידולים וזיהום 8,9.

מחקרים אחרונים הראו כי פגיעה עצבית היקפית מניעה נוירונים תחושתיים לבטא מולקולות לא מסתגלות כגון stathmin 2 (STMN2) ו- RAE1. כך, באמצעות מגע בין תאים, תאי NK המבטאים NKG2D הופעלו על ידי אינטראקציה עם נוירונים המבטאים RAE1. בתורו, תאי NK היו מסוגלים לחסל נוירונים nociceptor פצוע קהה רגישות יתר כאב קשורה בדרך כלל עם פגיעה עצבית10. בנוסף לציר NKG2D-RAE1, תאי NK מבטאים את הקולטנים הקוגנטיים עבור מתווכים שונים המיוצרים על ידי nociceptor. לכן ייתכן שהמתווכים האלה מווסתים את פעילות תאי ה-NK. מאמר זה מציג שיטת תרבית משותפת כדי לחקור את הביולוגיה של האינטראקציה בין תאי הנוירון-NK של nociceptor. גישה זו תסייע לקדם את ההבנה כיצד נוירונים של nociceptor מווסתים תגובות של תאי חיסון מולדים לפציעה, זיהום או ממאירות.

Protocol

הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מונטריאול (#22053, #22054) אישרו את כל ההליכים לבעלי חיים. ראה טבלה 1 לקבלת רשימה של פתרונות והרכבם וטבלת החומרים לקבלת רשימה של חומרים, ציוד וריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה. 1. בידוד תאי NK, תרבית וגירוי</str…

Representative Results

תאי NK טוהרו באופן מגנטי מבקרת פסולת (TRPV1 wt::D TAfl/wt) של עכברים ספלנוציטים ועוררו (48 שעות) עם IL-2 ו-IL-15. לאחר מכן תאי ה-NK גודלו בתרבית בלבד או בתרבית משותפת עם נוירוני DRG שנקטפו מנוירון נוסיצפטור שלם (בקרת פסולת; TRPV1 wt::D TA fl/wt) או עכברים אבלטים (TRPV1cre::D TAfl/wt). לאחר מכן נ…

Discussion

Davies et al.11 מצאו שתאי עצב פצועים מווסתים את RAE1. באמצעות מגע בין תאים, תאי NK המבטאים NKG2D הצליחו לזהות ולחסל נוירונים RAE1+ , אשר בתורם מגבילים כאב כרוני11. בהתחשב בכך שתאי NK מבטאים גם קולטני נוירופפטידים שונים, וכי נוירופפטידים אלה ידועים ביכולותיהם האימונומוד?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר New Frontiers in Research (NFRFE201901326), המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (162211, 461274, 461275), הקרן הקנדית לחדשנות (37439), תוכנית קתדרה למחקר בקנדה (950-231859), המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה (RGPIN-2019-06824), ו- Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).

Materials

Anti-mouse CD16/32 Jackson Laboratory Cat no: 017769
B-27 Jackson Laboratory Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade World Precision Instruments Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1 Fisher Scientific Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm) Fisher Scientific Cat no: A3160702
Collagenase IV Fisher Scientific Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl Fisher Scientific Cat no: SH3057402
Dispase II Fisher Scientific Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit Sigma Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Cat no: C0130
FACSAria III Sigma Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS) Sigma Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46 Sigma Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate Sigma Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette Sigma Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) VWR Cat no: 02-0131
Laminin Cedarlane Cat no: 03-50/31
L-Glutamine Gibco Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15 Gibco Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2 Gibco Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF) Life Technologies Cat no: 13257-019
Neurobasal media PeproTech Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF PeproTech Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin PeproTech Cat no: 210-15
Pestles Stem Cell Technology Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS) Biolegend Cat no: 108732 Clone PK136
RPMI 1640 media Biolegend Cat no: 137606 Clone 29A1.4
TRPV1Cre Biolegend Cat no: 505406 Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools. Biolegend Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate Biolegend Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780 Becton Dickinson

References

  1. Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
  2. Baral, P., et al. Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia. Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).
  3. Binshtok, A. M., et al. Nociceptors are interleukin-1beta sensors. Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).
  4. Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. Neuro-immune regulation of mucosal physiology. Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).
  5. Samad, T. A., et al. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).
  6. Godinho-Silva, C., et al. Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis. Nature. 574, 254-258 (2019).
  7. Talbot, J., et al. Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier. Nature. 579, 575-580 (2020).
  8. Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).
  9. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331, 44-49 (2011).
  10. Davies, A. J., et al. Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury. Cell. 176, 716-728 (2019).
  11. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2, 100333 (2021).
  12. Goswami, S. C., et al. Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis. Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).
  13. Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 30, 582-593 (2011).
  14. Kim, H. S., et al. Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism. Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).

Play Video

Cite This Article
Ahmadi, A., Balood, M., Roversi, K., Ahmadi, M., Rafei, M., Talbot, S. Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons. J. Vis. Exp. (184), e63800, doi:10.3791/63800 (2022).

View Video