Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작
Summary
Entomopathogenic 선충류는 박테리아와 공생하며 함께 선천적 인 면역 체계를 손상시켜 곤충을 성공적으로 감염시킵니다. 선충류 감염의 유전 적 기초에 대한 연구를 촉진하기 위해 엔토모 병원성 선충류를 유지하고 유 전적으로 조작하는 방법이 설명됩니다.
Abstract
Heterorhabditis 및 Steinernema 속의 Entomopathogenic 선충류는 토양에 사는 곤충의 의무적 인 기생충입니다. 그들의 수명주기의 주요 특징은 박테리아 Photorhabdus 및 Xenorhabdus와의 상호 연관성입니다. 선충류 기생충은 적절한 곤충 숙주를 찾아 진입하고, 곤충 면역 반응을 전복시키고, 효율적으로 번식하여 새로운 곤충 먹이를 적극적으로 사냥하여 감염시킬 다음 세대를 생산할 수 있습니다. 수명주기의 특성으로 인해 엔토모 병원성 선충류는 파괴적인 농업 곤충 해충을 방제하기 위해 살충제와 함께 사용되는 인기있는 생물학적 방제제입니다. 동시에,이 기생 선충류는 선충류 병원성을 분석하고 항 선충류 반응을 숙주로하는 연구 도구를 나타냅니다. 이 연구는 감염 동안 선충류 분비 분자의 역할을 이해하기위한 유전 기술 및 전사 학적 접근법의 최근 개발에 의해 도움을받습니다. 여기에서, 엔토모병원성 선충류를 유지하고 유전자 녹다운 절차를 사용하는 것에 대한 상세한 프로토콜이 제공된다. 이러한 방법론은 엔토모병원성 선충류 감염 인자의 기능적 특성화를 더욱 촉진한다.
Introduction
entomopathogenic nematodes (EPN)에 대한 연구는 통합 해충 관리 전략에서 이러한 기생충의 유용성과 기본 생물 의학 연구 1,2에 대한 참여로 인해 지난 몇 년 동안 강화되었습니다. 최근 연구들은 EPN을 감염 과정의 여러 단계에서 활성화되는 선충류 유전 성분을 검사하는 모델 유기체로 확립했다. 이 정보는 숙주 생리학을 변화시키고 곤충 선천적 면역 반응을 불안정하게 하기 위해 기생충에 의해 분비되는 분자의 성질 및 수에 대한 중요한 단서를 제공한다(3,4). 동시에,이 지식은 일반적으로 곤충 숙주 면역 신호 전달 경로의 유형과 병원균 5,6의 진입 및 확산을 제한하기 위해 규제하는 기능에 대한 새로운 세부 사항에 의해 보완됩니다. 이러한 과정을 이해하는 것은 EPN과 곤충 숙주 간의 역동적 인 상호 작용의 양면을 구상하는 데 중요합니다. EPN-곤충 숙주 관계에 대한 더 나은 인식은 의심 할 여지없이 포유류 기생 선충류와의 유사한 연구를 촉진 할 것이며, 이는 인간 면역 체계를 방해하는 감염 인자의 확인 및 특성화로 이어질 수 있습니다.
EPN 선충류 Heterorhabditis sp. 및 Steinernema sp.는 광범위한 곤충을 감염시킬 수 있으며 생물학은 이전에 집중적으로 연구되었습니다. 두 선충류 기생충은 이종 횡문염이 스스로 수정되고 Steinernema가 양서류 번식을 겪고있는 번식 방식이 다르지만 최근에는 S. hermaphroditum이 헤르마프로디테스의 자체 수정 또는 분파생성 7,8,9을 통해 번식하는 것으로 나타났습니다. Heterorhabditis와 Steinernema 선충류의 또 다른 차이점은 곤충의 강력한 병원균 인 그람 음성 박테리아 인 Photorhabdus와 Xenorhabdus의 두 가지 별개의 속을 가진 공생 적 상호 작용입니다. 이 박테리아는 EPN의 자유 생활 및 비 먹이 감염성 청소년 (IJ) 단계에서 발견되며, 민감한 숙주를 탐지하고 곤충 헤모코엘에 접근하여 빠르게 복제되는 관련 박테리아를 방출하고 곤충 조직을 식민지화합니다. EPN과 박테리아 모두 곤충 방어를 해제하고 항상성을 손상시키는 독성 요인을 생성합니다. 곤충 사망 후, 선충류 IJ는 성인 EPN이되어 수명주기를 완료하기 위해 발전합니다. 곤충 사체 내에서 식량 부족과 과밀에 대응하여 형성된 새로운 IJ의 코호트가 마침내 토양에서 나타나 적절한 숙주 9,10,11,12를 사냥합니다.
여기에서, EPN 선충류를 유지, 증폭 및 유전적으로 조작하기 위한 효율적인 프로토콜이 기재되어 있다. 특히, 프로토콜은 공생 H. 박테리오포라 및 S. carpocapsae IJs의 복제, 축삭 선충류 IJs의 생성, 미세주사를 위한 H. 박테리오포라 헤르마프로디테스의 생산, dsRNA의 제조, 및 미세주사 기술을 개략적으로 기술한다. 이러한 방법은 선충류 병원성 및 숙주 항선충류 면역의 분자 기초를 이해하는 데 필수적입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
엔토모병원성 선충류 감염 및 곤충 항선충류 면역의 분자 기초를 이해하려면 상호 연관된 박테리아 13,15,16으로부터 기생충의 분리가 필요하다. 엔토모병원성 선충류 H. bacteriophora 및 S. carpocapsae는 각각 그람 음성 박테리아 P. luminescens 및 X. nematophila와 함께 살며,17. 두 박테리아 종 모…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고의 비판적 읽기에 대한 조지 워싱턴 대학의 생물 과학과의 구성원에게 감사드립니다. 모든 그래픽 수치는 BioRender를 사용하여 제작되었습니다. I. E., J. H., 및 D. O’H.에서의 연구. 실험실은 George Washington University와 Columbian College of Arts and Sciences가 기금과 학제 간 연구 기금을 촉진하여 지원해 왔습니다.
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
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