Cultivo y manipulación genética de nematodos entomopatógenos
Summary
Los nematodos entomopatógenos viven en simbiosis con las bacterias y juntos infectan con éxito a los insectos al socavar su sistema inmunológico innato. Para promover la investigación sobre la base genética de la infección por nematodos, se describen métodos para mantener y manipular genéticamente los nematodos entomopatógenos.
Abstract
Los nematodos entomopatógenos de los géneros Heterorhabditis y Steinernema son parásitos obligados de insectos que viven en el suelo. La principal característica de su ciclo de vida es la asociación mutualista con las bacterias Photorhabdus y Xenorhabdus, respectivamente. Los parásitos nematodos son capaces de localizar e ingresar a los huéspedes de insectos adecuados, subvertir la respuesta inmune del insecto y multiplicarse de manera eficiente para producir la próxima generación que cazará activamente nuevas presas de insectos para infectar. Debido a las propiedades de su ciclo de vida, los nematodos entomopatógenos son agentes de control biológico populares, que se utilizan en combinación con insecticidas para controlar las plagas destructivas de insectos agrícolas. Simultáneamente, estos nematodos parásitos representan una herramienta de investigación para analizar la patogenicidad de los nematodos y las respuestas anti-nematodos del huésped. Esta investigación es ayudada por el reciente desarrollo de técnicas genéticas y enfoques transcriptómicos para comprender el papel de las moléculas secretadas por nematodos durante la infección. Aquí, se proporciona un protocolo detallado sobre el mantenimiento de nematodos entomopatógenos y el uso de un procedimiento de eliminación de genes. Estas metodologías promueven aún más la caracterización funcional de los factores de infección por nematodos entomopatógenos.
Introduction
La investigación sobre nematodos entomopatógenos (NPP) se ha intensificado en los últimos años debido principalmente a la utilidad de estos parásitos en las estrategias de manejo integrado de plagas y su participación en la investigación biomédica básica 1,2. Estudios recientes han establecido la EPN como organismos modelo en los que examinar los componentes genéticos de los nematodos que se activan durante las diferentes etapas del proceso de infección. Esta información proporciona pistas críticas sobre la naturaleza y el número de moléculas secretadas por los parásitos para alterar la fisiología del huésped y desestabilizar la respuesta inmune innata del insecto 3,4. Al mismo tiempo, este conocimiento se complementa comúnmente con nuevos detalles sobre el tipo de vías de señalización inmune del huésped insecto y las funciones que regulan para restringir la entrada y propagación de los patógenos 5,6. Comprender estos procesos es crucial para visualizar ambos lados de la interacción dinámica entre EPN y sus insectos huéspedes. Una mejor apreciación de la relación EPN-insecto huésped sin duda facilitará estudios similares con nematodos parásitos de mamíferos, lo que puede conducir a la identificación y caracterización de factores de infección que interfieren con el sistema inmunológico humano.
Los nematodos EPN Heterorhabditis sp. y Steinernema sp. pueden infectar a una amplia gama de insectos, y su biología ha sido intensamente estudiada anteriormente. Los dos parásitos nematodos difieren en su modo de reproducción, siendo Heterorhabditis autofertilizada y Steinernema sometida a reproducción amphíctica, aunque recientemente se demostró que S. hermaphroditum se reproduce por autofertilización de hermafroditas o a través de partenogénesis 7,8,9. Otra diferencia entre heterorhabditis y nematodos Steinernema es su mutualismo simbiótico con dos géneros distintos de bacterias Gram-negativas, Photorhabdus y Xenorhabdus, respectivamente, que son ambos potentes patógenos de insectos. Estas bacterias se encuentran en la etapa juvenil infecciosa (IJ) de vida libre y no alimenticia de la EPN, que detecta huéspedes susceptibles, obtiene acceso al hemocoel de insectos donde liberan sus bacterias asociadas que se replican rápidamente y colonizan los tejidos de los insectos. Tanto la EPN como sus bacterias producen factores de virulencia que desarman las defensas de los insectos y perjudican la homeostasis. Después de la muerte del insecto, los IJ nematodos se desarrollan para convertirse en EPN adultos y completar su ciclo de vida. Una nueva cohorte de IJ formada en respuesta a la privación de alimentos y el hacinamiento dentro del cadáver de insectos finalmente emerge en el suelo para cazar huéspedes adecuados 9,10,11,12.
Aquí, se describe un protocolo eficiente para mantener, amplificar y manipular genéticamente los nematodos EPN. En particular, el protocolo describe la replicación de los IJ simbióticos H. bacteriophora y S. carpocapsae , la generación de IJ de nematodos axénicos, la producción de hermafroditas de H. bacteriophora para microinyección, la preparación del dsRNA y la técnica de microinyección. Estos métodos son esenciales para comprender las bases moleculares de la patogenicidad de los nematodos y la inmunidad anti-nematodos del huésped.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprender las bases moleculares de la infección por nematodos entomopatógenos y la inmunidad antineomatodos de insectos requiere la separación de los parásitos de las bacterias mutuamente asociadas 13,15,16. Los nematodos entomopatógenos H. bacteriophora y S. carpocapsae conviven con las bacterias Gram-negativas P. luminescens y X. nematophila, respectivamente17. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad George Washington por la lectura crítica del manuscrito. Todas las figuras gráficas se hicieron utilizando BioRender. Investigación en el I. E., J. H. y D. O’H. los laboratorios han sido apoyados por la Universidad George Washington y el Colegio Colombino de Artes y Ciencias facilitando fondos y Fondos de Investigación Interdisciplinaria.
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
References
- Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
- Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
- Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
- Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -. H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. 遗传学. 220 (1), (2021).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
- Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
- Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
- Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
- Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
- Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
- Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
- McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).
