Utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilenimina (PEI), producimos partículas lentivirales para la expresión estable de shRNAs en células madre embrionarias humanas H9 (hESC) y células progenitoras neurales derivadas de H9 (NPC) transducidas transitoriamente con alta eficiencia.
El protocolo actual describe el uso de partículas lentivirales para la entrega de ARN de horquilla corta (shRNA) tanto a células madre embrionarias humanas (hESC) como a células progenitoras neurales (NPC) derivadas de hESCs de alta eficiencia. Las partículas lentivirales se generaron mediante la co-transfección de células HEK293T utilizando vectores de entrada (portadores de shRNAs) junto con plásmidos de empaquetamiento (pAX y pMD2.G) utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilinimina (PEI). Las partículas virales se concentraron mediante ultracentrifugación, lo que dio lugar a títulos medios superiores a 5 x 107. Tanto las hESC como las NPC podrían infectarse a altas eficiencias utilizando estas partículas lentivirales, como lo demuestra la selección de puromicina y la expresión estable en las hESC, así como la expresión transitoria de GFP en las NPC. Además, el análisis de Western Blot mostró una reducción significativa en la expresión de genes dirigidos por shRNAs. Además, las células conservaron su pluripotencia, así como su potencial de diferenciación, como lo demuestra su posterior diferenciación en diferentes linajes del SNC. El protocolo actual se ocupa de la entrega de shRNAs; sin embargo, el mismo enfoque podría utilizarse para la expresión ectópica de los ADNc para los estudios de sobreexpresión.
Las células madre embrionarias humanas (hESCs) derivadas de la masa celular interna del blastocisto son pluripotentes y pueden diferenciarse en diferentes tipos de células dependiendo de factores externos en condiciones in vitro 1,2. Con el fin de aprovechar plenamente el potencial de las hESC, es imperativo contar con métodos de administración de genes rápidos y confiables para estas células. Convencionalmente, las técnicas utilizadas se pueden clasificar ampliamente en dos tipos: sistemas de administración de genes no virales y virales 3,4. Los sistemas de administración de genes no virales más utilizados son la lipofección, la electroporación y la nucleofección. Los sistemas de administración no viral son ventajosos debido a la menor cantidad de mutaciones de inserción y una disminución general de la inmunogenicidad 5,6. Sin embargo, estos métodos dan como resultado una baja eficiencia de transfección y una corta duración de la expresión génica transitoria, lo que es una limitación importante para los estudios de diferenciación a largo plazo7. La electroporación da como resultado mejores eficiencias de transfección en comparación con la lipofección; sin embargo, resulta en más del 50% de muerte celular 8,9,10. Utilizando la nucleofection, la supervivencia celular y la eficiencia de la transfección se pueden mejorar combinando lipofección y electroporación, pero el enfoque necesita tampones específicos de la célula y equipos especializados y, por lo tanto, se vuelve bastante costoso para aplicaciones ampliadas11,12.
Por el contrario, los vectores virales han mostrado una mejora en la eficiencia de la transfección, así como una baja citotoxicidad general, después de la transducción. Además, los genes entregados se expresan de manera estable y, por lo tanto, hacen que este método sea ideal para estudios a largo plazo13. Entre los vectores virales más utilizados para la entrega de genes en hESCs se encuentran los vectores lentivirales (LVS), que pueden dar más del 80% de eficiencia de transducción utilizando partículas virales de alto título14,15. La lipofección y la precipitación de CaPO4 se encuentran entre los métodos más utilizados para transfectar transitoriamente las células HEK293T o sus derivados con vectores de transferencia de genes junto con plásmidos de empaquetamiento para producir partículas lentivirales16. Aunque la lipofección da como resultado una buena eficiencia de transfección y una baja citotoxicidad, la técnica se ve obstaculizada por su costo, y la ampliación para obtener partículas lentivirales de alto título sería muy costosa. La precipitación de CaPO4 da como resultado eficiencias de transfección relativamente similares a las obtenidas mediante lipofección. Aunque rentable, la precipitación de CaPO4 resulta en una muerte celular significativa después de las transfecciones, lo que dificulta la estandarización y evitar variaciones de lote a lote17. En este escenario, el desarrollo de un método que brinde una alta eficiencia de transfección, baja citotoxicidad y rentabilidad es crucial para la producción de partículas lentivirales de alto título que se utilizarán en hESC.
La polietilenimina (PEI) es un polímero catiónico que puede transfectar células HEK293T a alta eficiencia sin mucha citotoxicidad y tiene un costo insignificante en comparación con los métodos basados en lipofección18. En esta situación, pei se puede utilizar para aplicaciones ampliadas de producción de LVS de alto título a través de la concentración de partículas lentivirales de sobrenadantes de cultivo utilizando diversas técnicas. El artículo presentado describe el uso de PEI para transfectar células HEK293T y la concentración de vectores lentivirales utilizando ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa. Usando este método, obtenemos regularmente títulos muy por encima de 5 x 107 UI / ml con bajas variaciones de lote a lote. El método es simple, directo y rentable para aplicaciones ampliadas para la entrega de genes a células derivadas de hESCs y hESCs.
La capacidad de modificar genéticamente las células madre con fines de estudio o clínicos está limitada tanto por la tecnología como por la comprensión básica de la biología de las hESC. Las técnicas que han mostrado un potencial significativo en las ESC de ratón, como la lipofección y la electroporación, no son altamente eficientes para las hESC, que son notoriamente difíciles para la administración de genes por métodos convencionales20. Esta noción ha llevado no solo a la optimiz…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Universidad de los Emiratos Árabes Unidos (UAEU), la subvención # 31R170 (Centro Zayed de Ciencias de la Salud) y # 12R010 (beca UAEU-AUA). Agradecemos al profesor Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) por ayudarnos a editar el manuscrito por estilo y gramática.
Todos los datos están disponibles bajo petición.
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
XAV 939 | Tocris | 3748/10 |