Administración mediada por lentiviral de shRNAs a hESCs y NPCs usando polietileno de polímero catiónico de bajo costo (PEI)

Summary

Utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilenimina (PEI), producimos partículas lentivirales para la expresión estable de shRNAs en células madre embrionarias humanas H9 (hESC) y células progenitoras neurales derivadas de H9 (NPC) transducidas transitoriamente con alta eficiencia.

Abstract

El protocolo actual describe el uso de partículas lentivirales para la entrega de ARN de horquilla corta (shRNA) tanto a células madre embrionarias humanas (hESC) como a células progenitoras neurales (NPC) derivadas de hESCs de alta eficiencia. Las partículas lentivirales se generaron mediante la co-transfección de células HEK293T utilizando vectores de entrada (portadores de shRNAs) junto con plásmidos de empaquetamiento (pAX y pMD2.G) utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilinimina (PEI). Las partículas virales se concentraron mediante ultracentrifugación, lo que dio lugar a títulos medios superiores a 5 x 10⁷. Tanto las hESC como las NPC podrían infectarse a altas eficiencias utilizando estas partículas lentivirales, como lo demuestra la selección de puromicina y la expresión estable en las hESC, así como la expresión transitoria de GFP en las NPC. Además, el análisis de Western Blot mostró una reducción significativa en la expresión de genes dirigidos por shRNAs. Además, las células conservaron su pluripotencia, así como su potencial de diferenciación, como lo demuestra su posterior diferenciación en diferentes linajes del SNC. El protocolo actual se ocupa de la entrega de shRNAs; sin embargo, el mismo enfoque podría utilizarse para la expresión ectópica de los ADNc para los estudios de sobreexpresión.

Introduction

Las células madre embrionarias humanas (hESCs) derivadas de la masa celular interna del blastocisto son pluripotentes y pueden diferenciarse en diferentes tipos de células dependiendo de factores externos en condiciones in vitro ^1,2. Con el fin de aprovechar plenamente el potencial de las hESC, es imperativo contar con métodos de administración de genes rápidos y confiables para estas células. Convencionalmente, las técnicas utilizadas se pueden clasificar ampliamente en dos tipos: sistemas de administración de genes no virales y virales ^3,4. Los sistemas de administración de genes no virales más utilizados son la lipofección, la electroporación y la nucleofección. Los sistemas de administración no viral son ventajosos debido a la menor cantidad de mutaciones de inserción y una disminución general de la inmunogenicidad ^5,6. Sin embargo, estos métodos dan como resultado una baja eficiencia de transfección y una corta duración de la expresión génica transitoria, lo que es una limitación importante para los estudios de diferenciación a largo plazo⁷. La electroporación da como resultado mejores eficiencias de transfección en comparación con la lipofección; sin embargo, resulta en más del 50% de muerte celular ^8,9,10. Utilizando la nucleofection, la supervivencia celular y la eficiencia de la transfección se pueden mejorar combinando lipofección y electroporación, pero el enfoque necesita tampones específicos de la célula y equipos especializados y, por lo tanto, se vuelve bastante costoso para aplicaciones ampliadas^11,12.

Por el contrario, los vectores virales han mostrado una mejora en la eficiencia de la transfección, así como una baja citotoxicidad general, después de la transducción. Además, los genes entregados se expresan de manera estable y, por lo tanto, hacen que este método sea ideal para estudios a largo plazo¹³. Entre los vectores virales más utilizados para la entrega de genes en hESCs se encuentran los vectores lentivirales (LVS), que pueden dar más del 80% de eficiencia de transducción utilizando partículas virales de alto título^14,15. La lipofección y la precipitación de CaPO₄ se encuentran entre los métodos más utilizados para transfectar transitoriamente las células HEK293T o sus derivados con vectores de transferencia de genes junto con plásmidos de empaquetamiento para producir partículas lentivirales¹⁶. Aunque la lipofección da como resultado una buena eficiencia de transfección y una baja citotoxicidad, la técnica se ve obstaculizada por su costo, y la ampliación para obtener partículas lentivirales de alto título sería muy costosa. La precipitación de CaPO₄ da como resultado eficiencias de transfección relativamente similares a las obtenidas mediante lipofección. Aunque rentable, la precipitación de CaPO₄ resulta en una muerte celular significativa después de las transfecciones, lo que dificulta la estandarización y evitar variaciones de lote a lote¹⁷. En este escenario, el desarrollo de un método que brinde una alta eficiencia de transfección, baja citotoxicidad y rentabilidad es crucial para la producción de partículas lentivirales de alto título que se utilizarán en hESC.

La polietilenimina (PEI) es un polímero catiónico que puede transfectar células HEK293T a alta eficiencia sin mucha citotoxicidad y tiene un costo insignificante en comparación con los métodos basados en lipofección¹⁸. En esta situación, pei se puede utilizar para aplicaciones ampliadas de producción de LVS de alto título a través de la concentración de partículas lentivirales de sobrenadantes de cultivo utilizando diversas técnicas. El artículo presentado describe el uso de PEI para transfectar células HEK293T y la concentración de vectores lentivirales utilizando ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa. Usando este método, obtenemos regularmente títulos muy por encima de 5 x 10⁷ UI / ml con bajas variaciones de lote a lote. El método es simple, directo y rentable para aplicaciones ampliadas para la entrega de genes a células derivadas de hESCs y hESCs.

Protocol

1. Transfección de células HEK293T utilizando el reactivo PEI o Lipofectamine 3000 Cultivo de células HEK293T en DMEM + 10% FBS + 1x penicilina/estreptomicina a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% co2 y 21% O2 hasta que sean 90% confluentes antes de la siembra para transfección. Utilice un número relativamente bajo de células de paso para la producción de virus de alto título (idealmente menos de P30). Sembrar 4 x 106…

Representative Results

Después de la transferencia de genes, inevitablemente se requiere una alta viabilidad de hESCs. A pesar de los esfuerzos y la optimización de los protocolos para reducir la muerte celular después de la electroporación de hESCs, más del 50% de la muerte celular todavía se observa después de la electroporación de estas células, junto con la baja eficiencia de transfección20. La transferencia de genes mediada por lentivirales no solo resulta en una alta eficiencia de transferencia de genes,…

Discussion

La capacidad de modificar genéticamente las células madre con fines de estudio o clínicos está limitada tanto por la tecnología como por la comprensión básica de la biología de las hESC. Las técnicas que han mostrado un potencial significativo en las ESC de ratón, como la lipofección y la electroporación, no son altamente eficientes para las hESC, que son notoriamente difíciles para la administración de genes por métodos convencionales²⁰. Esta noción ha llevado no solo a la optimiz…

Materials

2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10