Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi
Summary
Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC’ler) shRNA’ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC’ler) yüksek verimlilikte.
Abstract
Mevcut protokol, kısa saç tokası RNA’larının (shRNA’lar) hem insan embriyonik kök hücrelerine (hESC’ler) hem de hESC’lerden türetilen nöral progenitör hücrelere (NPC’ler) yüksek verimlilikte verilmesi için lentiviral parçacıkların kullanımını açıklamaktadır. Lentiviral parçacıklar, düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanılarak ambalaj plazmidleri (pAX ve pMD2.G) ile birlikte giriş vektörleri (shRNA’lar taşıyan) kullanılarak HEK293T hücrelerinin birlikte transfekte edilmesiyle üretildi. Viral parçacıklar ultrasantrifüjleme kullanılarak konsantre edildi, bu da ortalama titrelerin 5 x 107’nin üzerinde olmasına neden oldu. Hem hESC’ler hem de NPC’ler, püromisin seçimi ve hESC’lerde kararlı ekspresyonun yanı sıra NPC’lerde geçici GFP ekspresyonu ile gösterildiği gibi, bu lentiviral partiküller kullanılarak yüksek verimlilikte enfekte olabilir. Ayrıca, batı leke analizi, shRNA’lar tarafından hedeflenen genlerin ekspresyonunda önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Ek olarak, hücreler, CNS’nin farklı soylarına daha sonraki farklılaşmalarıyla kanıtlandığı gibi, pluripotensilerini ve farklılaşma potansiyellerini korudular. Mevcut protokol, shRNA’ların verilmesi ile ilgilidir; Bununla birlikte, aynı yaklaşım aşırı ekspresyon çalışmaları için cDNA’ların ektopik ekspresyonu için de kullanılabilir.
Introduction
Blastosist iç hücre kütlesinden türetilen insan embriyonik kök hücreleri (hESC’ler) pluripotenttir ve in vitro koşullar altında dış etkenlere bağlı olarak farklı hücre tiplerine ayrılabilir 1,2. hESC’lerin potansiyelini tam olarak kullanmak için, bu hücreler için hızlı ve güvenilir gen dağıtım yöntemlerine sahip olmak zorunludur. Geleneksel olarak, kullanılan teknikler genel olarak iki tipte sınıflandırılabilir: viral olmayan ve viral gen dağıtım sistemleri 3,4. Daha sık kullanılan nonviral gen taşıyıcı sistemler lipofeksiyon, elektroporasyon ve nükleofeksiyondur. Nonviral dağıtım sistemleri, daha az yerleştirme mutasyonu ve immünojenisitedeki genel azalma nedeniyle avantajlıdır 5,6. Bununla birlikte, bu yöntemler düşük transfeksiyon etkinliği ve kısa süreli geçici gen ekspresyonu ile sonuçlanır, bu da uzun süreli farklılaşma çalışmaları için önemli bir sınırlamadır7. Elektroporasyon, lipofeksiyona kıyasla daha iyi transfeksiyon verimliliği sağlar; ancak %50’den fazla hücre ölümüile sonuçlanır 8,9,10. Nükleofeksiyon kullanılarak, lipofeksiyon ve elektroporasyon birleştirilerek hücre sağkalımı ve transfeksiyon verimliliği artırılabilir, ancak yaklaşım hücreye özgü tamponlara ve özel ekipmanlara ihtiyaç duyar ve bu nedenle ölçeklendirilmiş uygulamalar için oldukça maliyetli hale gelir11,12.
Buna karşılık, viral vektörler, transdüksiyonu takiben transfeksiyon verimliliklerinin yanı sıra genel olarak düşük sitotoksisiteyi de göstermiştir. Ek olarak, verilen genler istikrarlı bir şekilde ifade edilir ve bu nedenle bu yöntemi uzun süreli çalışmalar için ideal kılar13. hESC’lere gen iletimi için en sık kullanılan viral vektörler arasında, yüksek titreli viral parçacıklar14,15 kullanarak% 80’den fazla transdüksiyon verimliliği sağlayabilen lentiviral vektörler (LVS) bulunmaktadır. Lipofeksiyon ve CaPO4 çökeltmesi, HEK293T hücrelerini veya türevlerini gen transfer vektörleri ile geçici olarak transfekte etmek için en yaygın kullanılan yöntemler arasındadır ve lentiviral parçacıklar üretmek için plazmidleri paketlemektedir16. Lipofeksiyon iyi transfeksiyon etkinliği ve düşük sitotoksisite ile sonuçlanmasına rağmen, teknik maliyeti nedeniyle engellenir ve yüksek titreli lentiviral parçacıklar elde etmek için ölçeklendirilmesi çok maliyetli olacaktır. CaPO4 çökelmesi, lipofeksiyon kullanılarak elde edilenlere nispeten benzer transfeksiyon verimlilikleri ile sonuçlanır. Uygun maliyetli olmasına rağmen, CaPO4 çökeltisi, transfeksiyonları takiben önemli hücre ölümü ile sonuçlanır, bu da standardizasyonu ve partiden partiye varyasyonlardan kaçınmayı zorlaştırır17. Bu senaryoda, yüksek transfeksiyon verimliliği, düşük sitotoksisite ve maliyet etkinliği sağlayan bir yöntem geliştirmek, hESC’lerde kullanılacak yüksek titreli lentiviral parçacıkların üretimi için çok önemlidir.
Polietilenimin (PEI), HEK293T hücrelerini fazla sitotoksisite olmadan yüksek verimlilikte transfekte edebilen ve lipofeksiyon bazlı yöntemlere kıyasla ihmal edilebilir bir maliyeti olan katyonik bir polimerdir18. Bu durumda, PEI, çeşitli teknikler kullanılarak kültür süpernatantlarından lentiviral parçacıkların konsantrasyonu yoluyla yüksek titreli LVS üretiminin ölçeklendirilmiş uygulamaları için kullanılabilir. Sunulan makalede, HEK293T hücrelerini ve lentiviral vektör konsantrasyonunu transfekte etmek için PEI’nin bir sakkaroz yastığı aracılığıyla ultrasantrifüjleme kullanılarak kullanımı açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, düzenli olarak 5 x 107 IU / mL’nin çok üzerinde, düşük partiden partiye varyasyonlara sahip titreler elde ediyoruz. Yöntem, hESC’lere ve hESC’lerden türetilmiş hücrelere gen iletimi için ölçeklendirilmiş uygulamalar için basit, basit ve uygun maliyetlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kök hücreleri çalışma veya klinik amaçlar için genetik olarak değiştirme yeteneği, hem teknoloji hem de hESC’lerin biyolojisinin temel anlayışı ile sınırlıdır. Lipofeksiyon ve elektroporasyon gibi fare ESC’lerinde önemli potansiyel gösteren teknikler, geleneksel yöntemlerle gen iletimi için oldukça zor olan hESC’ler için oldukça verimli değildir20. Bu kavram sadece mevcut tekniklerin optimizasyonuna değil, aynı zamanda hESC’lerde transfeksiyon verimliliğinin arttırılm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Birleşik Arap Emirlikleri Üniversitesi’nden (BAEÜ), hibe # 31R170 (Zayed Sağlık Bilimleri Merkezi) ve # 12R010’dan (UAEU-AUA hibesi) araştırma hibeleri ile desteklenmiştir. Prof. Randall Morse’a (Wadsworth Center, Albany, NY) makaleyi stil ve dilbilgisi açısından düzenlememize yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.
Tüm veriler talep üzerine temin edilebilir.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
- Strulovici, Y., Leopold, P. L., O’Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
- Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
- Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
- Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
- Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
- Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
- Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
- Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
- Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017 (2016).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
- Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
- Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
- Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
- Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).
