Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais
Summary
O protocolo demonstra que, realizando microtransplante de membranas sinápticas em oócitos Xenopus laevis , é possível registrar respostas consistentes e confiáveis de receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropônico e receptores de ácido γ-aminobutírico.
Abstract
Receptores ionotrópicos excitatórios e inibitórios são os principais portões de fluxos de íons que determinam a atividade de sinapses durante a comunicação neurológica fisiológica. Portanto, alterações em sua abundância, função e relações com outros elementos sinápticos têm sido observadas como uma grande correlação de alterações na função cerebral e comprometimento cognitivo em doenças neurodegenerativas e transtornos mentais. Entender como a função dos receptores sinápticos excitatórios e inibitórios é alterada pela doença é de fundamental importância para o desenvolvimento de terapias eficazes. Para obter informações relevantes sobre doenças, é importante registrar a atividade elétrica de receptores neurotransmissores que permanecem funcionais no cérebro humano doente. Até agora esta é a abordagem mais próxima para avaliar alterações patológicas na função dos receptores. Neste trabalho, é apresentada uma metodologia para realizar a microtransplantação de membranas sinápticas, que consiste em reativar membranas sinápticas a partir de tecido cerebral humano congelado que contém receptores humanos, por sua injeção e fusão posterior na membrana de oócitos Xenopus laevis . O protocolo também fornece a estratégia metodológica para obter respostas consistentes e confiáveis dos receptores α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic ácido (AMPA) e γ-aminobutírico (GABA), bem como novos métodos detalhados que são usados para normalização e análise rigorosa de dados.
Introduction
Distúrbios neurodegenerativos afetam grande parte da população. Embora suas consequências devastadoras sejam bem conhecidas, a ligação entre as alterações funcionais dos receptores neurotransmissores, que são críticas para a função cerebral, e sua sintomatologia ainda é mal compreendida. A variabilidade inter-individual, a natureza crônica da doença e o início insidioso dos sintomas são apenas algumas das razões que atrasaram a compreensão das muitas doenças cerebrais onde os desequilíbrios químicos estão bem documentados 1,2. Modelos animais geraram informações inestimáveis e expandiram nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes à fisiologia e à fisiopatologia em sistemas conservados evolutivos; no entanto, várias diferenças entre roedores e humanos impedem a extrapolação direta da função receptora de modelos animais para o cérebro humano3. Assim, os esforços iniciais para estudar receptores humanos nativos foram desenvolvidos pelo laboratório de Ricardo Miledi utilizando tecido removido cirurgicamente e amostras congeladas. Esses experimentos iniciais utilizaram membranas inteiras que incluem receptores sinápticos neuronais e extra-sinápticos, bem como receptores neurotransmissores não neuronais, e embora forneçam informações importantes sobre estados doentes, há uma preocupação de que a mistura de receptores complica a interpretação dos dados 4,5,6,7. É importante ressaltar que as sinapses são o principal alvo em muitas doenças neurodegenerativas 8,9; portanto, ensaios para testar as propriedades funcionais das sinapses afetadas são fundamentais para obter informações sobre mudanças relevantes para a doença que afetam a comunicação sináptica. Aqui, descreve-se uma modificação do método original: microtransplantação de membranas sinápticas (MSM), que se concentra na caracterização fisiológica de preparações de proteína sináptica enriquecida e foi aplicada com sucesso para estudar sinapttos de ratos e humanos 10,11,12,13,14,15 . Com essa metodologia, é possível transplantar receptores sinápticos que antes trabalhavam no cérebro humano, embutidos em seus próprios lipídios nativos e com sua própria coorte de proteínas associadas. Além disso, como os dados do MSM são quantitativos, é possível usar esses dados para se integrar com grandes conjuntos de dados proteômicos ou sequenciamento10.
É importante notar que muitas análises farmacológicas e biofísicas de receptores sinápticos são feitas em proteínas recombinantes16,17. Embora essa abordagem forneça uma melhor visão das relações estrutura-função dos receptores, não pode fornecer informações sobre complexos receptores multimédicos encontrados nos neurônios e suas mudanças na doença. Portanto, uma combinação de proteínas nativas e recombinantes deve fornecer uma análise mais abrangente dos receptores sinápticos.
Existem muitos métodos para preparar sinapstos 10,11,12,13,14,15 que podem ser ajustados para os requisitos de um laboratório. O protocolo começa com a suposição de que as preparações enriquecidas sinaptosômicas foram isoladas e estão prontas para serem processadas para experimentos de microtransplante. No laboratório, o método Syn-Per é usado seguindo as instruções do fabricante. Isso é feito por causa da alta reprodutibilidade em experimentos eletrofisiológicos10,11. Há também literatura abundante explicando como isolar xenopus oócitos18,19, que também podem ser comprados prontos para injeção20.
Protocol
Representative Results
Discussion
A análise de complexos proteicos nativos do cérebro humano é necessária para entender processos homeostáticos e patológicos em distúrbios cerebrais e desenvolver estratégias terapêuticas para prevenir ou tratar doenças. Assim, os bancos cerebrais contendo amostras congeladas instantâneas são uma fonte inestimável de uma grande e principalmente inexplorada riqueza de informações fisiológicas29,30. Uma preocupação inicial para o uso do tecido pós…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIA/NIH R01AG070255 e R01AG073133 à AL. Agradecemos também ao Centro de Pesquisa da Doença de Alzheimer Irvine da Universidade da Califórnia (UCI-ADRC) por fornecer o tecido humano mostrado neste manuscrito. O UCI-ADRC é financiado pela concessão do NIH/NIA P30 AG066519.
Materials
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
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