Fonksiyonel Çalışmalar için İnsan Sinaptik Reseptörlerini Yeniden Aktive Etmek için Sinaptik Membranların Mikrotransplantasyonu
Summary
Protokol, sinaptik membranların Xenopus laevis oositlerine mikrotransplantasyonunu gerçekleştirerek, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit ve γ-aminobütirik asit reseptörlerinin tutarlı ve güvenilir yanıtlarını kaydetmenin mümkün olduğunu göstermektedir.
Abstract
Uyarıcı ve inhibitör iyonotropik reseptörler, fizyolojik nöronal iletişim sırasında sinapsların aktivitesini belirleyen iyon akılarının başlıca kapılarıdır. Bu nedenle, bollukları, işlevleri ve diğer sinaptik elementlerle olan ilişkilerindeki değişiklikler, nörodejeneratif hastalıklarda ve zihinsel bozukluklarda beyin fonksiyonlarındaki değişikliklerin ve bilişsel bozulmanın önemli bir korelasyonu olarak gözlenmiştir. Uyarıcı ve inhibitör sinaptik reseptörlerin fonksiyonlarının hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini anlamak, etkili tedavilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Hastalıkla ilgili bilgi edinmek için, hastalıklı insan beyninde işlevsel kalan nörotransmitter reseptörlerinin elektriksel aktivitesini kaydetmek önemlidir. Şimdiye kadar bu, reseptörlerin fonksiyonundaki patolojik değişiklikleri değerlendirmek için en yakın yaklaşımdır. Bu çalışmada, insan reseptörleri içeren donmuş insan beyin dokusundan sinaptik membranların Xenopus laevis oositlerinin membranına enjeksiyonu ve posterior füzyonu ile yeniden aktive edilmesinden oluşan sinaptik membranların mikrotransplantasyonunu gerçekleştirmek için bir metodoloji sunulmuştur. Protokol ayrıca, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) ve γ-aminobütirik asit (GABA) reseptörlerinin tutarlı ve güvenilir yanıtlarını elde etmek için metodolojik stratejinin yanı sıra normalizasyon ve titiz veri analizi için kullanılan yeni ayrıntılı yöntemler sunmaktadır.
Introduction
Nörodejeneratif bozukluklar nüfusun büyük bir yüzdesini etkiler. Yıkıcı sonuçları iyi bilinmesine rağmen, beyin fonksiyonu için kritik olan nörotransmitter reseptörlerinin fonksiyonel değişiklikleri ile semptomatolojileri arasındaki bağlantı hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bireyler arası değişkenlik, hastalığın kronik doğası ve semptomların sinsi başlangıcı, kimyasal dengesizliklerin iyi belgelendiği birçok beyin bozukluğunun anlaşılmasını geciktiren nedenlerden sadece birkaçıdır 1,2. Hayvan modelleri, evrimsel korunmuş sistemlerde fizyoloji ve patofizyolojinin altında yatan mekanizmalar hakkında paha biçilmez bilgiler üretmiş ve bilgimizi genişletmiştir; Bununla birlikte, kemirgenler ve insanlar arasındaki çeşitli türler arası farklılıklar, hayvan modellerinden insan beynine reseptör fonksiyonunun doğrudan ekstrapolasyonunu engellemektedir3. Bu nedenle, yerli insan reseptörlerini incelemek için ilk çabalar, Ricardo Miledi’nin laboratuvarı tarafından cerrahi olarak çıkarılmış doku ve dondurulmuş örnekler kullanılarak geliştirilmiştir. Bu ilk deneylerde, nöronal sinaptik ve ekstra sinaptik reseptörlerin yanı sıra nöronal olmayan nörotransmitter reseptörlerini içeren tüm membranlar kullanılmıştır ve hastalıklı durumlar hakkında önemli bilgiler sağlamalarına rağmen, reseptörlerin karışımınınverilerin yorumlanmasını zorlaştırdığı endişesi vardır 4,5,6,7. Daha da önemlisi, sinapslar birçok nörodejeneratif bozuklukta ana hedeftir 8,9; Bu nedenle, etkilenen sinapsların fonksiyonel özelliklerini test etmek için yapılan testler, sinaptik iletişimi etkileyen hastalıkla ilgili değişiklikler hakkında bilgi edinmek için esastır. Burada, orijinal yöntemin bir modifikasyonu açıklanmaktadır: zenginleştirilmiş sinaptik protein preparatlarının fizyolojik karakterizasyonuna odaklanan ve sıçan ve insan sinaptozomlarını incelemek için başarıyla uygulanan sinaptik membranların mikrotransplantasyonu (MSM) 10,11,12,13,14,15 . Bu metodolojiyle, bir zamanlar insan beyninde çalışan, kendi doğal lipitlerine gömülü sinaptik reseptörleri ve kendi ilişkili protein kohortlarıyla nakletmek mümkündür. Ayrıca, MSM verileri nicel olduğundan, bu verileri büyük proteomik veya sıralama veri kümeleriyle tümleştirmek için kullanmak mümkündür10.
Sinaptik reseptörlerin birçok farmakolojik ve biyofiziksel analizinin rekombinant proteinler üzerinde yapıldığını belirtmek önemlidir16,17. Bu yaklaşım, reseptörlerin yapı-fonksiyon ilişkileri hakkında daha iyi bir fikir verirken, nöronlarda bulunan karmaşık multimerik reseptör kompleksleri ve bunların hastalıktaki değişiklikleri hakkında bilgi sağlayamaz. Bu nedenle, doğal ve rekombinant proteinlerin bir kombinasyonu, sinaptik reseptörlerin daha kapsamlı bir analizini sağlamalıdır.
Bir laboratuvarın gereksinimlerine göre ayarlanabilen10,11,12,13,14,15 sinaptozomlarını hazırlamak için birçok yöntem vardır. Protokol, sinaptozomal zenginleştirilmiş preparatların izole edildiği ve mikrotransplantasyon deneyleri için işlenmeye hazır olduğu varsayımıyla başlar. Laboratuvarda, üretici talimatlarını izleyerek Syn-Per yöntemi kullanılır. Bu, elektrofizyolojik deneylerde yüksek tekrarlanabilirlik nedeniyle yapılır10,11. Ayrıca, enjeksiyon20 için hazır olarak satın alınabilen Xenopus oositleri 18,19’un nasıl izole edileceğini açıklayan çok sayıda literatür vardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beyin bozukluklarında homeostatik ve patolojik süreçleri anlamak ve hastalıkları önlemek veya tedavi etmek için terapötik stratejiler geliştirmek için insan beyninden doğal protein komplekslerinin analizi gereklidir. Bu nedenle, çıtçıtlı dondurulmuş örnekler içeren beyin bankaları, büyük ve çoğunlukla kullanılmayan fizyolojik bilgi zenginliğinin paha biçilmez bir kaynağıdır29,30. Postmortem dokuyu kullanmak için ilk endişe, veriler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, AL’ye NIA/NIH hibeleri R01AG070255 ve R01AG073133 tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu makalede gösterilen insan dokusunu sağladığı için California Üniversitesi Irvine Alzheimer hastalığı araştırma merkezine (UCI-ADRC) teşekkür ederiz. UCI-ADRC, NIH / NIA hibesi P30 AG066519 tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
References
- Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer’s disease patients. Journal of Alzheimer’s Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
- Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
- Hodge, R. v. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
- Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
- Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138 (2018).
- Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
- Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer’s disease. Nature Communications. 12 (1), 2603 (2021).
- Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
- Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
- Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
- Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
- Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
- Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
- Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
- Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
- Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
- Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
- Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
- C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
- Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
- Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
- Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
- Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
- Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
- Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
- Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
- Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
- Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
- Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).
