نموذج العلاج المناعي التجريبي للورم الميلانيني باستخدام التطعيم ضد الورم باستخدام السيتوكين المكونة للدم
Summary
يقدم البروتوكول نموذجا للعلاج المناعي للسرطان باستخدام التطعيم ضد الورم القائم على الخلايا مع سرطان الجلد B16-F10 المعبر عن Flt3L. يوضح هذا البروتوكول الإجراءات ، بما في ذلك تحضير الخلايا السرطانية المستزرعة ، وزرع الورم ، وتشعيع الخلايا ، وقياس نمو الورم ، وعزل الخلايا المناعية داخل الورم ، وتحليل قياس التدفق الخلوي.
Abstract
التيروزين كيناز 3 ليجند الشبيه ب Fms (Flt3L) هو سيتوكين مكون للدم يعزز بقاء وتمايز الخلايا المتغصنة (DCs). تم استخدامه في لقاحات الأورام لتنشيط المناعة الفطرية وتعزيز الاستجابات المضادة للأورام. يوضح هذا البروتوكول نموذجا علاجيا باستخدام لقاح الورم القائم على الخلايا الذي يتكون من خلايا الورم الميلانيني B16-F10 المعبرة عن Flt3L جنبا إلى جنب مع التحليل الظاهري والوظيفي للخلايا المناعية في البيئة المكروية للورم (TME). يتم وصف إجراءات تحضير الخلايا السرطانية المستزرعة ، وزرع الورم ، وتشعيع الخلايا ، وقياس حجم الورم ، وعزل الخلايا المناعية داخل الورم ، وتحليل قياس التدفق الخلوي. الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير نموذج العلاج المناعي للورم الصلب قبل السريري ، ومنصة بحثية لدراسة العلاقة بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية المتسللة. يمكن دمج بروتوكول العلاج المناعي الموصوف هنا مع طرق علاجية أخرى ، مثل حصار نقاط التفتيش المناعية (الأجسام المضادة ل CTLA-4 ، والأجسام المضادة ل PD-1 ، والأجسام المضادة ل PD-L1) أو العلاج الكيميائي من أجل تحسين التأثير العلاجي للسرطان لسرطان الجلد.
Introduction
تم التعرف على العلاج المناعي للسرطان كاستراتيجية علاجية واعدة بناء على آثاره الجانبية الأقل سمية والاستجابات الأكثر ديمومة. تم تطوير عدة أنواع من العلاجات المناعية ، بما في ذلك علاجات فيروس الأورام ، ولقاحات السرطان ، وعلاجات السيتوكين ، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، ونقل الخلايا بالتبني (خلايا CAR-T أو CAR-NK) ، وحصار نقطة التفتيش المناعية1.
بالنسبة للقاحات السرطان ، هناك أشكال مختلفة من اللقاحات العلاجية ، مثل اللقاحات القائمة على الخلايا الكاملة ، ولقاحات البروتين أو الببتيد ، ولقاحات الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي. يعتمد التطعيم على قدرة الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) على معالجة مستضدات الورم ، بما في ذلك المستضدات الخاصة بالورم ، وتقديمها في شكل مناعي للخلايا التائية. من المعروف أن الخلايا المتغصنة (DCs) هي أقوى APCs ويعتقد أنها تلعب دورا مهما في المناعة المضادة للأورام 2,3. تمتص هذه الخلايا مستضدات الورم وتعالجها ، ثم تهاجر إلى الغدد الليمفاوية المستنزفة (dLN) لتجهيز وتنشيط خلايا المستجيب التائية الخاصة بالورم (Teff) من خلال إشراك مستقبلات الخلايا التائية (TCR) والجزيئات المكلفة. ينتج عن هذا تمايز وتوسع الخلايا التائية السامة للورم (CTL) ، والتي تتسلل إلى الورم وتقتل الخلايا السرطانية4. وبالتالي ، فإن تنشيط ونضج DCs يمثلان استراتيجيات جذابة لتحفيز المناعة ضد مستضدات الورم.
من المعروف أن Flt3L يعزز نضوج وتوسع DCs الناضجة وظيفيا التي تعبر عن بروتينات MHC من الفئة II و CD11c و DEC205 و CD865. ثبت أن الإدارة داخل الورم ، ولكن ليس عن طريق الوريد ، لناقل الفيروس الغدي الذي يتضمن جين Flt3L (Adv-Flt3L) تعزز النشاط العلاجي المناعي ضد أورام الخصية6. كما تم استخدام Flt3L في اللقاحات القائمة على الخلايا السرطانية التي تتكون من خلايا B16-F10 المشععة التي تعبر بثبات عن Flt3L المحول بالفيروسات القهقرية كوسيلة لتعزيز العرض المتقاطع لمستضدات الورم بواسطة DCs ، وبالتالي زيادة الاستجابات المضادة للأورام. يعتمد بروتوكول التطعيم ضد الورم B16-Flt3L الموصوف هنا على دراسة نشرتها مجموعة الدكتور جيمس أليسون7. في هذه الورقة ، أفادوا أن لقاح B16-Flt3L جنبا إلى جنب مع حصار CTLA-4 أدى بشكل تآزري إلى رفض سرطان الجلد الثابت ، مما أدى إلى زيادة البقاء على قيد الحياة.
الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نموذج العلاج المناعي قبل السريري لسرطان الجلد. هنا ، يتم وصف الإجراءات التفصيلية لكيفية تحضير وزرع لقاحات الورم ، وكيفية تحليل تكوين ووظيفة الخلايا المناعية داخل الورم من الورم الصلب.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتمد البروتوكول الموصوف هنا على الدراسة التي أجرتها مجموعة أليسون. لقد أظهروا أن الجمع بين لقاح B16-Flt3L مع حصار CTLA-4 أظهر تأثيرا تآزريا على معدل البقاء على قيد الحياة ونمو الورم ، في حين لم يلاحظ أي انخفاض في نمو الورم في الفئران التي تتلقى لقاح B16-Flt3L أو علاج الأجسام المضادة ل CTLA-4 وحده<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ستيفن شوينبيرجر على توفير خلايا B16-Flt3L وموظفي مرافق قياس الحيوان والتدفق الخلوي LJI للحصول على دعم ممتاز.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
| 30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
| B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
| GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| Antibodies | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
References
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
- Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
- Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280 (2004).
- Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
- Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
- Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).
- Salmon, H., et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Liu, H. Y., et al. Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).
- Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).
