조혈 사이토카인을 사용한 종양 백신 접종을 이용한 실험적 흑색종 면역요법 모델
Summary
이 프로토콜은 Flt3L 발현 B16-F10 흑색종으로 세포 기반 종양 백신 접종을 사용하는 암 면역 요법 모델을 제시합니다. 이 프로토콜은 배양된 종양 세포의 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 성장 측정, 종양내 면역 세포의 분리 및 유세포 분석을 포함한 절차를 보여줍니다.
Abstract
Fms 유사 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3L)는 수지상 세포 (DCs)의 생존 및 분화를 촉진하는 조혈 사이토 카인이다. 선천성 면역을 활성화하고 항 종양 반응을 향상시키기 위해 종양 백신에 사용되었습니다. 이 프로토콜은 종양 미세 환경 (TME)에서 면역 세포의 표현형 및 기능 분석과 함께 Flt3L 발현 B16-F10 흑색 종 세포로 구성된 세포 기반 종양 백신을 사용하는 치료 모델을 보여줍니다. 배양된 종양 세포 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 크기 측정, 종양내 면역 세포 단리, 및 유세포분석을 위한 절차가 기재되어 있다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 전임상 고형 종양 면역 요법 모델과 종양 세포와 침윤 면역 세포 간의 관계를 연구하기위한 연구 플랫폼을 제공하는 것입니다. 여기에 기술된 면역요법 프로토콜은 흑색종의 암 치료 효과를 개선하기 위해 면역 체크포인트 차단 (항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-PD-L1 항체) 또는 화학요법과 같은 다른 치료 양식과 조합될 수 있다.
Introduction
암 면역 요법은 독성이 적은 부작용과 더 지속적인 반응을 기반으로 유망한 치료 전략으로 인식되어 왔습니다. 종양 용해 바이러스 요법, 암 백신, 사이토 카인 요법, 단일 클론 항체, 입양 세포 전달 (CAR-T 세포 또는 CAR-NK) 및 면역 체크 포인트 차단1을 포함하는 여러 유형의 면역 요법이 개발되었습니다.
암 백신의 경우 전체 세포 기반 백신, 단백질 또는 펩타이드 백신, RNA 또는 DNA 백신과 같은 다양한 형태의 치료 백신이 있습니다. 백신 접종은 종양 특이 항원을 포함한 종양 항원을 처리하고 T 세포에 면역 원성 형태로 제시하는 항원 제시 세포 (APC)의 능력에 의존합니다. 수지상 세포(DC)는 가장 강력한 APC로 알려져 있으며 항종양 면역에 중요한 역할을 하는 것으로 믿어집니다 2,3. 이 세포는 종양 항원을 흡수하고 처리 한 다음 배수 림프절 (dLN)으로 이동하여 T 세포 수용체 (TCR) 및 공동 자극 분자의 결합을 통해 종양 특이 적 T 이펙터 (Teff) 세포를 프라이밍하고 활성화합니다. 그 결과 종양 특이적 세포독성 T 세포(CTL)의 분화 및 확장이 일어나 종양에 침투하여종양 세포를 사멸시킵니다4. 결과적으로, DC의 활성화 및 성숙은 종양 항원에 대한 면역을 자극하는 매력적인 전략을 나타낸다.
Flt3L은 MHC 클래스 II, CD11c, DEC205 및 CD86 단백질5를 발현하는 기능적으로 성숙한 DC의 성숙 및 확장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. Flt3L 유전자(Adv-Flt3L)를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 정맥내 투여는 오르토픽 종양에 대한 면역 치료 활성을 촉진하는 것으로나타났습니다6. Flt3L은 또한 DC에 의한 종양 항원의 교차 제시를 향상시켜 항종양 반응을 증가시키는 방법으로 후방바이러스 형질도입된 Flt3L을 안정적으로 발현하는 방사선 조사된 B16-F10 세포로 구성된 종양 세포 기반 백신에 사용되었습니다. 여기에 설명된 B16-Flt3L 종양 백신 접종 프로토콜은 James Allison 박사의 그룹7에서 발표한 연구를 기반으로 합니다. 이 논문에서 그들은 CTLA-3 차단과 결합 된 B4-Flt4L 백신이 상승적으로 확립 된 흑색 종의 거부를 유도하여 생존율을 증가 시킨다고보고했습니다.
이 프로토콜의 목표는 흑색종에 대한 전임상 면역요법 모델을 제공하는 것입니다. 여기에서는 종양 백신을 제조하고 이식하는 방법과 고형 종양으로부터 종양 내 면역 세포의 구성과 기능을 분석하는 방법에 대한 자세한 절차를 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 Allison 그룹의 연구를 기반으로 합니다. 그들은 B16-Flt3L 백신과 CTLA-4 차단의 조합이 생존율과 종양 성장에 시너지 효과를 보인 반면, B16-Flt3L 백신 또는 항 CTLA-4 항체 단독 치료를받은 마우스에서는 종양 성장의 감소가 보이지 않았 음을 입증했다7. 최근 연구에 따르면 Treg11의 접촉 의존적 억제 활성을 조절하는 데 중요한 필수 역할을하?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B16-Flt3L 세포를 제공한 Stephen Schoenberger 박사와 LJI 동물 및 유세포분석 시설의 직원들에게 탁월한 지원을 해주셔서 감사합니다.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
| 30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
| B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
| GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| Antibodies | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
References
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