Reconstitution de l’assemblage de septines au niveau des membranes pour étudier les propriétés et les fonctions biophysiques
Summary
La reconstitution sans cellules a été un outil clé pour comprendre l’assemblage du cytosquelette, et les travaux de la dernière décennie ont établi des approches pour étudier la dynamique des septines dans des systèmes minimaux. Voici trois méthodes complémentaires pour observer l’assemblage de septines dans différents contextes membranaires : les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tiges.
Abstract
La plupart des cellules peuvent sentir et changer leur forme pour effectuer des processus cellulaires fondamentaux. Chez de nombreux eucaryotes, le cytosquelette septine fait partie intégrante de la coordination des changements de forme tels que la cytocinèse, la croissance polarisée et la migration. Les septines sont des protéines formant des filaments qui s’assemblent pour former diverses structures d’ordre supérieur et, dans de nombreux cas, se trouvent dans différentes zones de la membrane plasmique, notamment dans les régions de courbure positive à l’échelle du micron. La surveillance du processus d’assemblage de la septine in vivo est entravée par les limites de la microscopie optique dans les cellules, ainsi que par la complexité des interactions avec les membranes et les éléments cytosquelettiques, ce qui rend difficile la quantification de la dynamique de la septine dans les systèmes vivants. Heureusement, il y a eu des progrès substantiels au cours de la dernière décennie dans la reconstitution du cytosquelette de septine dans un système sans cellule pour disséquer les mécanismes contrôlant l’assemblage de la septine à des résolutions spatiales et temporelles élevées. Les principales étapes de l’assemblage de la septine comprennent l’association et la dissociation de l’hétérooligomère de septine avec la membrane, la polymérisation en filaments et la formation de structures d’ordre supérieur par le biais d’interactions entre filaments. Ici, nous présentons trois méthodes pour observer l’assemblage de septine dans différents contextes: les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tige. Ces méthodes peuvent être utilisées pour déterminer les paramètres biophysiques des septines à différents stades d’assemblage: en tant qu’octamères simples liant la membrane, en tant que filaments et en tant qu’assemblages de filaments. Nous utilisons ces paramètres associés à des mesures d’échantillonnage de courbure et d’adsorption préférentielle pour comprendre comment la détection de courbure fonctionne à diverses échelles de longueur et de temps.
Introduction
Les formes des cellules et beaucoup de leurs compartiments internes dépendent des membranes lipidiques qui les entourent. Les membranes sont des structures viscoélastiques qui peuvent être déformées par des interactions avec les protéines, le tri des lipides et l’action des forces internes et externes pour générer une variété de formes 1,2,3,4. Ces formes sont souvent décrites en termes de courbure de la membrane. Les cellules utilisent une suite diversifiée de protéines capables de s’assembler préférentiellement sur des courbures membranaires particulières ou de les « détecter » pour assurer un contrôle spatio-temporel défini sur des processus tels que le trafic cellulaire, la cytocinèse et la migration 5,6. La dynamique de la machinerie cellulaire au niveau de la membrane est particulièrement difficile à observer en raison de la difficulté d’équilibrer le temps et la résolution spatiale avec la santé cellulaire. Bien que les techniques de super-résolution puissent offrir une vue détaillée de ces structures, elles nécessitent de longues acquisitions qui ne se prêtent pas aux délais d’assemblage / démontage pour la plupart des machines. De plus, la complexité moléculaire de ces assemblages dans leur environnement natif et la multitude de rôles qu’un seul composant peut jouer font des systèmes de reconstitution minimaux un outil précieux pour étudier la capacité fonctionnelle des molécules.
Des mimétiques membranaires minimaux ont été développés pour étudier les propriétés membranaires et les interactions protéine-membrane à l’extérieur de la cellule. Les mimétiques membranaires varient des bicouches lipidiques autoportantes, telles que les liposomes ou les vésicules unilamellaires géantes, aux bicouches lipidiques supportées (SLB)7,8,9,10. Les SLB sont des membranes biomimétiques ancrées au support sous-jacent, généralement composées de verre, de mica ou de silice11,12. Une variété de géométries peut être utilisée, y compris des surfaces planes, des sphères, des bâtonnets et même des substrats ondulés ou micromotifs pour sonder les interactions protéine-membrane sur des courbures concaves et convexes simultanément1 3,14,15,16,17,18 . La formation de bicouches commence par l’adsorption des vésicules sur une surface hydrophile, suivie de la fusion et de la rupture pour former une bicouche continue (Figure 1)19. Les bicouches prises en charge se prêtent particulièrement à la lumière et à la microscopie électronique, offrant à la fois un meilleur temps et une meilleure résolution spatiale que ce qui est souvent réalisable dans les cellules. Les SLB incurvés offrent en particulier un moyen attrayant de sonder la sensibilité à la courbure des protéines en l’absence de déformation significative de la membrane, ce qui permet de distinguer la détection de courbure et l’induction de courbure, qui sont souvent impossibles à séparer dans les systèmes autonomes.
Les septines sont une classe de protéines cytosquelettiques formant des filaments bien connues pour leur capacité à s’assembler sur des membranes incurvées positivement 6,18,20. Au cours du cycle cellulaire de la levure, les septines s’assemblent en un anneau et doivent se réorganiser pour former les structures de sablier et de double anneau associées à l’émergence des bourgeons et à la cytokinèse, respectivement21. Bien que de beaux travaux aient été réalisés en utilisant la microscopie électronique à réplique de platine pour observer l’architecture des septines à différents stades du cycle cellulaire22, l’observation de l’assemblage des septines au fil du temps à l’aide de la microscopie optique dans la levure a rencontré une résolution spatiale limitée. Des travaux antérieurs sur les septines utilisant des monocouches lipidiques visualisées par microscopie électronique à transmission (TEM) ont permis de reconstituer plusieurs structures de septines intéressantes telles que des anneaux, des faisceaux et des gazes23. Cependant, les techniques EM sont également limitées dans leur résolution temporelle, contrairement à la microscopie à fluorescence. Afin de mieux résoudre les paramètres cinétiques du processus multi-échelle d’assemblage de septines, nous nous sommes tournés vers les mimétiques membranaires pris en charge, où l’on peut contrôler soigneusement la géométrie de la membrane, les conditions de l’échantillon et la modalité d’imagerie.
Les protocoles décrits ici utilisent des SLB planaires ou incurvés, des protéines purifiées et une combinaison de techniques de microscopie. La microscopie confocale quantitative à fluorescence et la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM) ont été utilisées pour mesurer à la fois la liaison des protéines en vrac sur diverses courbures membranaires, ainsi que pour mesurer la cinétique de liaison de molécules individuelles. De plus, ce protocole a été adapté pour être utilisé avec la microscopie électronique à balayage (MEB) pour examiner l’ultrastructure des protéines sur différentes courbures de membrane. Bien que ces protocoles se concentrent sur le cytosquelette septine, les protocoles peuvent être facilement modifiés pour étudier la sensibilité à la courbure de toute protéine que le lecteur trouve intéressante. En outre, ceux qui travaillent dans des domaines tels que l’endocytose ou le trafic vésiculeux peuvent trouver ces techniques utiles pour sonder les assemblages dépendants de la courbure des complexes multiprotéiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les membranes cellulaires prennent de nombreuses formes, courbures et propriétés physico-chimiques différentes. Afin d’étudier la machinerie à l’échelle nanométrique à travers laquelle les cellules construisent des assemblages à l’échelle micrométrique, il est nécessaire de concevoir des systèmes de reconstitution minimaux de mimétiques membranaires. Ce protocole présente des techniques qui contrôlent avec précision à la fois la courbure et la composition de la membrane tout en permettant à l’u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) Grant no. R01 GM-130934 et National Science Foundation (NSF) Grant MCB-2016022. B.N.C, E.J.D.V. et K.S.C. ont été soutenus en partie par une subvention de l’Institut national des sciences médicales générales sous le prix T32 GM119999.
Materials
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22×22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
References
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
- Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. 发育生物学. 401 (1), 92-102 (2015).
- Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
- Bigay, J., Casella, J. -. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
- Picard, F., Paquet, M. -. J., Dufourc, &. #. 2. 0. 1. ;. J., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
- Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
- Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).
- Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
- Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
- Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
- Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).
- Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Lou, H. -. Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
- Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).
- Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
- Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
- Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).
- Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
- Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
- Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
- Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).
- Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
- Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
- Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
- Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
- Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
