Восстановление сборки септина на мембранах для изучения биофизических свойств и функций
Summary
Бесклеточное восстановление было ключевым инструментом для понимания сборки цитоскелетов, и работа в последнее десятилетие установила подходы к изучению динамики септина в минимальных системах. Здесь представлены три взаимодополняющих метода наблюдения сборки септина в различных мембранных контекстах: плоские бислои, сферические опоры и стержневые опоры.
Abstract
Большинство клеток могут чувствовать и изменять свою форму для выполнения фундаментальных клеточных процессов. У многих эукариот цитоскелет септина является неотъемлемым компонентом в координации изменений формы, таких как цитокинез, поляризованный рост и миграция. Септины представляют собой нитеобразующие белки, которые собираются для формирования разнообразных структур более высокого порядка и, во многих случаях, обнаруживаются в разных областях плазматической мембраны, особенно в областях положительной кривизны микронного масштаба. Мониторинг процесса сборки септина in vivo затруднен ограничениями световой микроскопии в клетках, а также сложностью взаимодействий как с мембранами, так и с цитоскелетными элементами, что затрудняет количественную оценку динамики септина в живых системах. К счастью, за последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в воссоздании цитоскелета септина в бесклеточной системе для анализа механизмов, контролирующих сборку септина с высоким пространственным и временным разрешением. Основные этапы сборки септина включают ассоциацию гетероолигомера септина и диссоциацию с мембраной, полимеризацию в нити и образование структур более высокого порядка посредством взаимодействий между нитями. Здесь мы представляем три метода наблюдения сборки септина в разных контекстах: плоские бислои, сферические опоры и стержневые опоры. Эти методы могут быть использованы для определения биофизических параметров септинов на разных стадиях сборки: как одиночных октамеров, связывающих мембрану, как нитей, так и в виде сборок нитей. Мы используем эти параметры в сочетании с измерениями выборки кривизны и предпочтительной адсорбции, чтобы понять, как измерение кривизны работает в различных масштабах длины и времени.
Introduction
Формы клеток и многие из их внутренних компартментов зависят от липидных мембран, которые их окружают. Мембраны представляют собой вязкоупругие структуры, которые могут деформироваться посредством взаимодействия с белками, сортировки липидов и действующих внутренних и внешних сил для создания различных форм 1,2,3,4. Эти формы часто описываются в терминах кривизны мембраны. Клетки используют разнообразный набор белков, способных предпочтительно собираться или «ощущать» определенные кривизны мембраны для обеспечения определенного пространственно-временного контроля над процессами, включая клеточный трафик, цитокинез и миграцию 5,6. Динамику клеточного механизма на мембране особенно трудно наблюдать из-за сложности балансировки времени и пространственного разрешения со здоровьем клеток. Хотя методы сверхвысокого разрешения могут предложить подробное представление о таких структурах, они требуют длительных приобретений, которые не поддаются временным рамкам сборки / разборки для большинства машин. Кроме того, молекулярная сложность этих сборок в их родной среде и множество ролей, которые может играть один компонент, делают системы минимального восстановления ценным инструментом для изучения функциональной емкости молекул.
Минимальные мембранные миметики были разработаны для изучения свойств мембраны и белково-мембранных взаимодействий вне клетки. Мембранные миметики варьируются от отдельно стоящих липидных бислоев, таких как липосомы или гигантские одноцветные везикулы, до поддерживаемых липидных бислоев (SLB)7,8,9,10. SLB представляют собой биомиметические мембраны, прикрепленные к нижележащей опоре, обычно состоящие из стекла, слюды или кремнезема11,12. Различные геометрии могут быть использованы, включая плоские поверхности, сферы, стержни и даже волнообразные или микроструктурированные субстраты для зондирования белково-мембранных взаимодействий как на вогнутых, так и на выпуклых кривизнях одновременно1 3,14,15,16,17,18 . Образование бислоя начинается с адсорбции пузырьков на гидрофильной поверхности, за которой следует слияние и разрыв с образованием непрерывного бислоя (рисунок 1)19. Поддерживаемые бислои особенно поддаются световой и электронной микроскопии, обеспечивая как лучшее время, так и пространственное разрешение, чем это часто достигается в клетках. Изогнутые SLB особенно обеспечивают привлекательное средство для зондирования чувствительности к кривизне белка при отсутствии значительной деформации мембраны, позволяя различать зондирование кривизны и индукцию кривизны, которые часто невозможно разделить в отдельно стоящих системах.
Септины представляют собой класс нитеобразующих цитоскелетных белков, хорошо известных своей способностью собираться на положительно изогнутых мембранах 6,18,20. В течение клеточного цикла в дрожжах септины собираются в кольцо и должны перестраиваться, образуя песочные часы и двойные кольцевые структуры, связанные с появлением почек и цитокинезом, соответственно21. В то время как красивая работа была выполнена с использованием электронной микроскопии платиновой реплики для наблюдения архитектуры септина на различных стадиях клеточного цикла22, наблюдение за сборкой септина с течением времени с использованием световой микроскопии в дрожжах столкнулось с ограниченным пространственным разрешением. Предыдущая работа над септинами с использованием липидных монослоев, визуализированных с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ), смогла воссоздать несколько интересных структур септина, таких как кольца, пучки и марля23. Однако методы ЭМ также ограничены по своему временному разрешению, в отличие от флуоресцентной микроскопии. Чтобы лучше разрешить кинетические параметры многомасштабного процесса сборки септина, мы обратились к поддерживаемой мембранной миметике, где можно тщательно контролировать геометрию мембраны, условия образца и модальность визуализации.
Протоколы, описанные здесь, используют плоские или изогнутые SLB, очищенный белок и комбинацию методов микроскопии. Количественная флуоресцентная конфокальная микроскопия и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRFM) использовались для измерения как объемного связывания белка на различных кривизнах мембраны, так и для измерения кинетики связывания отдельных молекул. Кроме того, этот протокол был адаптирован для использования со сканирующей электронной микроскопией (SEM) для изучения ультраструктуры белка на различных кривизнах мембраны. В то время как основное внимание в этих протоколах уделяется септиновому цитоскелету, протоколы могут быть легко изменены для исследования чувствительности к кривизне любого белка, который читатель находит интересным. Кроме того, те, кто работает в таких областях, как эндоцитоз или везикулярный трафик, могут найти эти методы полезными для зондирования зависимых от кривизны сборок мультибелковых комплексов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Клеточные мембраны приобретают множество различных форм, кривизн и физико-химических свойств. Для изучения нанометрового механизма, с помощью которого клетки строят микрометровые сборки, необходимо спроектировать минимальные системы восстановления мембранной миметики. Этот проток?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Грантом Национального института здравоохранения (NIH) No. R01 GM-130934 и грант Национального научного фонда (NSF) MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. и K.S.C. были частично поддержаны грантом Национального института общих медицинских наук в рамках премии T32 GM119999.
Materials
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22×22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
References
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
- Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. 发育生物学. 401 (1), 92-102 (2015).
- Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
- Bigay, J., Casella, J. -. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
- Picard, F., Paquet, M. -. J., Dufourc, &. #. 2. 0. 1. ;. J., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
- Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
- Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).
- Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
- Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
- Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
- Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).
- Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Lou, H. -. Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
- Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).
- Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
- Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
- Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).
- Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
- Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
- Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
- Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).
- Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
- Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
- Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
- Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
- Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
