פרוטוקולים עבור CRISPR/Cas9 Mutagenesis של זבוב הפירות המזרחי Bactrocera dorsalis
Summary
מאמר זה מציג את הפרוטוקולים שלב אחר שלב עבור מוטגנזה של CRISPR/Cas9 של זבוב הפירות המזרחי Bactrocera dorsalis. צעדים מפורטים המסופקים על ידי פרוטוקול סטנדרטי זה ישמשו כמדריך שימושי ליצירת זבובים מוטנטים למחקרי גנים פונקציונליים ב – B. dorsalis.
Abstract
זבוב הפירות האוריינטלי, Bactrocera dorsalis, הוא מין מזיק פולש ומסתגל מאוד שגורם נזק להדרים וליותר מ-150 גידולי פרי אחרים ברחבי העולם. מכיוון שלזבובי פירות בוגרים יש יכולת מעוף גדולה והנקבות מטילות את ביציהן מתחת לקליפות הפרי, קוטלי חרקים הדורשים מגע ישיר עם המזיק בדרך כלל מתפקדים בצורה גרועה בשדה. עם פיתוח כלים ביולוגיים מולקולריים וטכנולוגיית ריצוף בתפוקה גבוהה, מדענים רבים מנסים לפתח אסטרטגיות הדברה ידידותיות לסביבה. אלה כוללים חומרי הדברה מבוססי RNAi או עריכת גנים אשר ממעיטים או משתיקים גנים (מטרות מולקולריות), כגון גנים של חוש הריח המעורבים בהתנהגות חיפוש, במזיקים שונים של חרקים. כדי להתאים אסטרטגיות אלה להדברת זבוב הפירות המזרחי, יש צורך בשיטות יעילות לחקר גנים פונקציונליים. גנים בעלי תפקידים קריטיים בהישרדות וברבייה של B. dorsalis משמשים כמטרות מולקולריות טובות להפלת גנים ו/או להשתקה. מערכת CRISPR/Cas9 היא טכניקה אמינה המשמשת לעריכת גנים, במיוחד בחרקים. מאמר זה מציג שיטה שיטתית למוטגנזה של קריספר/Cas9 של B. dorsalis, כולל תכנון וסינתזה של רנ”א מנחה, איסוף עוברים, הזרקת עוברים, גידול חרקים וסינון מוטנטי. פרוטוקולים אלה ישמשו כמדריך שימושי ליצירת זבובים מוטנטיים עבור חוקרים המעוניינים במחקרי גנים פונקציונליים ב– B. dorsalis.
Introduction
זבוב הפירות המזרחי (שם מדעי: Bactrocera dorsalis) הוא מין של חרק קוסמופוליטי הגורם נזק ליותר מ-150 מינים של גידולי פירות, בהם גויאבה, מנגו, יוג’ניה spp., דובדבן סורינאם, הדרים, שסק ופפאיה1. הנזק שנגרם במחוז גואנגדונג (סין) לבדו מוערך ביותר מ-200 מיליון יואן. נקבות בוגרות מכניסות את ביציהן מתחת לקליפת הפירות המבשילים או הבשילים, מה שגורם לריקבון ולפגיעה בפרי, מה שפוגע באיכות הפרי ובתנובה הכללית של היבול2. מכיוון שלזבובי פירות בוגרים יש יכולת מעוף גדולה והזחלים שלהם נשאו לתוך קליפת הפרי, קוטלי חרקים הדורשים מגע ישיר עם המזיק מתפקדים בצורה גרועה בשדה. בנוסף, השימוש הנרחב בקוטלי חרקים הגביר את עמידותו של B. dorsalis נגד כימיקלים חקלאיים שונים, מה שהופך את ההדברה של מזיקים מזיקים אלה לקשה עוד יותר3. לכן, פיתוח אסטרטגיות הדברה יעילות וידידותיות לסביבה נחוץ נואשות.
לאחרונה, עם פיתוח כלים ביולוגיים מולקולריים וטכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה, מדענים מנסים לפתח אסטרטגיות ידידותיות לסביבה להדברת מזיקים, כגון RNAi, המכוונות לפונקציונליות של גנים חשובים (מטרות מולקולריות) של מזיקים חרקים שונים. גנים שהם קריטיים להישרדותו ולהתרבותו של המזיק ניתנים לזיהוי באמצעות מחקרי גנים פונקציונליים ומשמשים גם כמטרות מולקולריות פוטנציאליות לשיפור כלי הדברה ממוקדים וידידותיים לסביבה4. כדי להתאים אסטרטגיות כאלה להדברת זבוב הפירות המזרחי, יש צורך בשיטות יעילות לחקר גנים פונקציונליים.
מערכת האנדונוקלאז CRISPR/Cas (מקובצת באופן קבוע בין חזרות פלינדרומיות קצרות/הקשורות לקריספר) התגלתה לראשונה בחיידקים ובארכיאה ונמצאה כמנגנון אדפטיבי המעורב בזיהוי ופירוק של דנ”א תוך-תאי זר, כמו זה שהוצג על ידי הדבקת בקטריופאג’ים5. במערכת הקריספר מסוג II, אנדונוקלאז Cas9 מונחה על ידי רנ”א קטנים הקשורים (crRNA ו- tracrRNA) כדי לבקע DNA מסיג גבול 6,7,8 והפך לאחד הכלים הנפוצים ביותר לעריכת גנים עד כה 9,10,11,12. מכיוון שלמערכת CRISPR/Cas9 יש מספר יתרונות, כגון יעילות גבוהה של השתקת גנים ועלות נמוכה, היא כבר יושמה לעריכת גנים במיני חרקים שונים, כולל Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 ו– Bombyx mori16. ב– B. dorsalis, גנים הקשורים לצבע הגוף, דימורפיזם כנפיים וקביעת מין הושמדו בהצלחה באמצעות CRISPR/Cas917,18,19. עם זאת, נהלים מפורטים ליישום CRISPR/Cas9 בחרק זה עדיין אינם שלמים. יתר על כן, כמה צעדים שסופקו על ידי חוקרים לעריכת גנים של B. dorsalis הם גם מגוונים וזקוקים לתקינה. לדוגמה, הצורות של Cas9 היו שונות בהפניות שפורסמו17,18,19.
מאמר זה מספק שיטה שיטתית למוטגנזה של B. dorsalis באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, כולל תכנון וסינתזה של רנ”א מנחים, איסוף עוברים, הזרקת עוברים, גידול חרקים וסינון מוטנטי. פרוטוקול זה ישמש כמדריך שימושי ליצירת זבובים מוטנטיים עבור חוקרים המעוניינים במחקרי הגנים הפונקציונליים ב– B. dorsalis.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת CRISPR/Cas9 היא הכלי הנפוץ ביותר לעריכת גנים ויש לה יישומים שונים, כגון תרפי גנים30, גידול יבולים 31, ומחקרים בסיסיים של חיטוי גנים32. מערכת זו כבר יושמה לעריכת גנים במיני חרקים שונים ושימשה כלי יעיל למחקרי גנים פונקציונליים במזיקים. הפרוטוקולים שאנו מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של שנזן (מענק מס ‘KQTD20180411143628272) וקרנות מיוחדות לחדשנות טכנולוגית מדעית ופיתוח תעשייתי של המחוז החדש של שנזן דפנג (מענק מס ‘PT202101-02).
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -. H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- . TransDecoder Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018)
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. 遗传学. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
