Protocolos para a Mutagênese CRISPR/Cas9 da Mosca da Fruta Oriental Bactrocera dorsalis
Summary
Este trabalho apresenta os protocolos passo-a-passo para a mutagênese CRISPR/Cas9 da mosca da fruta oriental Bactrocera dorsalis. Passos detalhados fornecidos por este protocolo padronizado servirão como um guia útil para a geração de moscas mutantes para estudos de genes funcionais em B. dorsalis.
Abstract
A mosca da fruta oriental, Bactrocera dorsalis, é uma espécie de praga altamente invasiva e adaptativa que causa danos aos citros e a mais de 150 outras culturas frutíferas em todo o mundo. Como as moscas da fruta adultas têm grande capacidade de voo e as fêmeas colocam seus ovos sob as cascas das frutas, os inseticidas que exigem contato direto com a praga geralmente têm um desempenho ruim no campo. Com o desenvolvimento de ferramentas biológicas moleculares e tecnologia de sequenciamento de alto rendimento, muitos cientistas estão tentando desenvolver estratégias de manejo de pragas ambientalmente amigáveis. Estes incluem RNAi ou pesticidas baseados em edição de genes que regulam ou silenciam genes (alvos moleculares), como genes olfativos envolvidos no comportamento de busca, em várias pragas de insetos. Para adaptar essas estratégias para o controle oriental da mosca da fruta, são necessários métodos eficazes para a pesquisa de genes funcionais. Genes com funções críticas na sobrevivência e reprodução de B. dorsalis servem como bons alvos moleculares para derrubada e/ou silenciamento de genes. O sistema CRISPR/Cas9 é uma técnica confiável usada para edição de genes, especialmente em insetos. Este trabalho apresenta um método sistemático para a mutagênese CRISPR/Cas9 de B. dorsalis, incluindo o desenho e síntese de RNAs guia, coleta de embriões, injeção de embriões, criação de insetos e triagem mutante. Esses protocolos servirão como um guia útil para a geração de moscas mutantes para pesquisadores interessados em estudos de genes funcionais em B. dorsalis.
Introduction
A mosca da fruta oriental, Bactrocera dorsalis , é uma espécie de praga de insetos cosmopolita que causa danos a mais de 150 espécies de culturas frutíferas, incluindo goiaba, manga, Eugenia spp., cereja do Suriname, cítricos, nêspera e mamão1. Os danos causados apenas na província de Guangdong (China) são estimados em mais de 200 milhões de yuans. As fêmeas adultas inserem seus ovos sob a pele dos frutos amadurecidos ou amadurecidos, causando decomposição e abscisão do fruto, o que diminui a qualidade dos frutos e o rendimento geral da cultura2. Como as moscas da fruta adultas têm grande capacidade de voo e suas larvas penetram na casca da fruta, os inseticidas que exigem contato direto com a praga têm um desempenho ruim no campo. Além disso, o uso extensivo de inseticidas aumentou a resistência de B. dorsalis contra diversos produtos químicos agrícolas, dificultando ainda mais o controle dessas pragas danosas3. Portanto, o desenvolvimento de estratégias eficazes e ambientalmente amigáveis de manejo de pragas é desesperadamente necessário.
Recentemente, com o desenvolvimento de ferramentas biológicas moleculares e tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, os cientistas estão tentando desenvolver estratégias de manejo de pragas ambientalmente amigáveis, como o RNAi, que visam a funcionalidade de genes importantes (alvos moleculares) de várias pragas de insetos. Genes que são críticos para a sobrevivência e reprodução da praga podem ser identificados por meio de estudos genéticos funcionais e ainda servem como potenciais alvos moleculares para a melhoria de ferramentas de manejo de pragas especificamente direcionadas e ambientalmente amigáveis4. Para adaptar tais estratégias ao controle oriental da mosca da fruta, são necessários métodos eficazes para a pesquisa de genes funcionais.
O sistema de endonuclease CRISPR/Cas (agrupado regularmente interespaçado repetições palindrômicas curtas/CRISPR-associado) foi inicialmente descoberto em bactérias e arqueias e encontrado para ser um mecanismo adaptativo envolvido no reconhecimento e degradação de DNA intracelular estranho, como o introduzido pela infecção de bacteriófagos5. No sistema CRISPR tipo II, a endonuclease Cas9 é guiada por pequenos RNAs associados (crRNA e tracrRNA) para clivar o DNA invasor 6,7,8 e tornou-se uma das ferramentas mais utilizadas para edição de genes até o momento 9,10,11,12. Como o sistema CRISPR/Cas9 apresenta diversas vantagens, como alta eficiência de silenciamento de genes e baixo custo, já foi aplicado para edição gênica em diversas espécies de insetos, incluindo Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 e Bombyx mori16. Em B. dorsalis, genes relacionados à cor corporal, dimorfismo das asas e determinação do sexo foram nocauteados com sucesso usando CRISPR/Cas917,18,19. No entanto, os procedimentos detalhados para a aplicação de CRISPR/Cas9 neste inseto permanecem incompletos. Além disso, algumas etapas fornecidas pelos pesquisadores para a edição do gene B. dorsalis também são variadas e precisam de padronização. Por exemplo, as formas de Cas9 foram diferentes nas referências publicadas17,18,19.
Este artigo fornece um método sistemático para mutagênese de B. dorsalis usando o sistema CRISPR/Cas9, incluindo o desenho e síntese de RNAs guia, coleta de embriões, injeção de embriões, criação de insetos e triagem mutante. Este protocolo servirá como um guia útil para a geração de moscas mutantes para pesquisadores interessados nos estudos de genes funcionais em B. dorsalis.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema CRISPR/Cas9 é a ferramenta de edição de genes mais utilizada e tem várias aplicações, como o genetrepia 30, o melhoramento de culturas31 e estudos básicos de funções gênicas32. Este sistema já foi aplicado para edição de genes em várias espécies de insetos e tem servido como uma ferramenta eficaz para estudos de genes funcionais em pragas. Os protocolos que apresentamos aqui padronizam o procedimento de desenho e síntese de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Shenzhen (Grant No. KQTD20180411143628272) e fundos especiais para inovação em tecnologia científica e desenvolvimento industrial do Novo Distrito de Shenzhen Dapeng (Grant No. PT202101-02).
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -. H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- . TransDecoder Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018)
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. 遗传学. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
