初代細胞および培養細胞からの細胞質および核長鎖RNAの調製
Summary
本プロトコルは、培養細胞を用いて核および細胞質画分からRNAを単離し、qPCRを用いて検証するための効率的で柔軟な方法を提供します。これは、他のRNA調製キットの代替品として効果的に機能します。
Abstract
細胞内成分の分離は、長年にわたって細胞生物学の重要なツールであり、それらの位置がそれらの機能にどのように影響するかについての有用な洞察を提供することができました。特に、核RNAと細胞質RNAの分離は、癌細胞の文脈や薬物の新しい標的の探求において重要になっています。核細胞質RNA抽出用のキットの購入は、必要な材料の多くが一般的なラボ環境で見つかる場合、コストがかかる可能性があります。より高価なキットやその他の時間のかかるプロセスを置き換えることができる現在の方法を使用する場合、核および細胞質RNAを単離するために必要なのは、自家製の溶解バッファー、ベンチトップ遠心分離機、およびRNA単離精製カラムのみです。溶解バッファーは、核膜の完全性に影響を与えることなく細胞の外膜を穏やかに溶解するために使用され、細胞内成分を放出することができます。次いで、核は溶解溶液よりも高い密度を有するので、単純な遠心分離工程によって単離することができる。遠心分離を利用して、密度の違いに基づいてこれらの領域を分離し、核内の細胞内要素を細胞質内の細胞内要素から分離します。遠心分離でさまざまな成分が単離されたら、RNAクリーンアップキットを使用してRNA含有量を精製し、qPCRを実行して分離品質を検証し、さまざまな画分中の核および細胞質RNAの量で定量します。統計的に有意なレベルの分離が達成され、プロトコルの有効性が示されました。さらに、このシステムは、さまざまな種類のRNA(総RNA、低分子RNAなど)の単離に適応できるため、細胞質と核の相互作用を標的に研究することができ、核と細胞質に存在するRNAの機能の違いを理解するのに役立ちます。
Introduction
細胞内成分への細胞分画は、定義された生化学的ドメインの単離と研究を可能にし、特定の細胞プロセスの局在とこれがそれらの機能にどのように影響するかを決定するのに役立ちます1。異なる細胞内位置からのRNAの単離は、転写レベルイベントおよび核と細胞質間の他の相互作用の遺伝的および生化学的分析の精度を向上させることができ、これは現在のプロトコル2の主な目的として機能します。このプロトコルは、細胞質RNAと核RNAを確実に分離して、核輸送におけるそれぞれの役割を決定し、核および細胞質内のRNAの細胞内局在が細胞プロセスにおけるそれらの機能にどのように影響するかを理解するために開発されました。典型的な実験室環境からの材料を使用して、結果の質を損なうことなく、以前に確立されたプロトコルよりも効果的かつ安価に核および細胞質分画を達成することができました3。
さらに、細胞質と核との間の分子の交換は、これらの領域を分離することによって直接研究することができる。具体的には、トランスクリプトームの理解は、発生や疾患を理解するために不可欠です。ただし、RNAはいつでも異なる成熟レベルにある可能性があり、ダウンストリーム分析を複雑にする可能性があります。このプロトコルにより、核および細胞質細胞内画分からRNAを単離することができ、RNAの研究に役立ち、ノンコーディングRNAの局在化や核内のスプライス接合部の分析など、関心のある特定のRNAをよりよく理解することができます。
このプロトコルは、mRNA、rRNA、および長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)を含む細胞質および核長鎖RNAの単離に最適化されており、利用されるRNA精製カラムのサイズ選択性により、目的の他のRNAを単離するために変更することができます。以前は、mRNAやlncRNAなどの長鎖RNAの機能は、細胞内でのそれぞれの局在に大きく依存していました4,5。したがって、核から細胞内ドメインへの輸出の研究は、RNAまたは他の細胞成分の輸出が細胞に与えることができる役割を理解することに向けられています。lncRNAは、その翻訳とその後の効果が他の形態のRNA6との近接性と相互作用に大きく依存するため、この代表的な例として機能します。さらに、核領域と細胞質領域間の細胞要素の交換は、さまざまな癌治療に対する耐性メカニズムに関連しています7。細胞内コンパートメントの単離により、核輸送阻害剤の開発が可能になり、さまざまな治療法に対する耐性メカニズムの影響が減少しました8。
核RNAおよび細胞質RNAを分離した後、目的のRNAを精製するステップが実行される。RNA精製キットは実験室で一般的に見られ、長いRNAを精製および分離するために機能するため、このプロトコルの目的を十分に果たします。RNA精製では、1.8を超える260:280の比率を生成することが、RNAシーケンシングまたは高レベルの純度と単離を必要とするその他の同様の手順のサンプルの品質を確保するために重要です。不規則な260:280の値はフェノール汚染を示し、分離性が不十分で不正確な結果をもたらします9。
RNA精製が完了し、260:280の値が許容範囲を超えていることが確認されたら、qPCRを利用して核画分と細胞質画分の単離結果を検証しました。その際、関心領域に特異的なプライマーを使用して、核および細胞質分画レベルを実証しました。このプロトコルでは、MALAT1およびTUG1がそれぞれ核マーカーおよび細胞質マーカーとして使用された10。これらを組み合わせることで、MALAT1による高レベルの核分画の実証が可能になりますが、細胞質分画は低いと予想されます。逆に、TUG1を使用した場合、細胞質分画レベルは核分画レベルよりも高くなると予想されます。
このプロトコルを利用することで、細胞内での作用位置に基づいてRNAを単離することが可能であった。この実験では、多くの材料への広範なアクセスと溶解バッファーおよび密度ベースの遠心分離技術のみの利用により、他のRNAタイプおよび他の細胞成分への適用性が広まっています。これは、分離しなければ区別できない場所固有の発現イベントに光を当てることによって重要な情報を提供することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコル全体を通して、目的の細胞株に最も効果的になるように要素を最適化するためにいくつかのステップが取られました。プロトコル内の手順は比較的簡単ですが、プロトコルの重要な側面で分析と微調整が必要になる場合があります。このプロトコルの最も重要なステップは、目的の細胞株と細胞標的に基づいて、溶解バッファーの濃度を適切な濃度に変更することです。溶解バッ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
米国血液学会、ロバートウッドジョンソン財団、ドリスデューク慈善財団、エドワードP.エバンス財団、および国立がん研究所(1K08CA230319)からの助成金によってサポートされています。
Materials
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
References
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