Preparación de ARN largos citoplasmáticos y nucleares a partir de células primarias y cultivadas

Summary

El presente protocolo ofrece un método eficiente y flexible para aislar ARN de fracciones nucleares y citoplasmáticas utilizando células cultivadas, y luego validar mediante qPCR. Esto sirve efectivamente como un reemplazo para otros kits de preparación de ARN.

Abstract

La separación de componentes intracelulares ha sido una herramienta clave en biología celular durante muchos años y ha sido capaz de proporcionar información útil sobre cómo su ubicación puede afectar su función. En particular, la separación del ARN nuclear y citoplasmático se ha vuelto importante en el contexto de las células cancerosas y la búsqueda de nuevos objetivos para los medicamentos. La compra de kits para la extracción de ARN citoplasmático nuclear puede ser costosa cuando muchos de los materiales requeridos se pueden encontrar dentro de un entorno de laboratorio típico. Usando el método actual, que puede reemplazar kits más costosos u otros procesos que consumen mucho tiempo, solo se necesita un amortiguador de lisis casero, una centrífuga de sobremesa y columnas de purificación de aislamiento de ARN para aislar el ARN nuclear y citoplasmático. El tampón de lisis se utiliza para lisar suavemente la membrana externa de la célula sin afectar la integridad de la envoltura nuclear, lo que permite liberar sus componentes intracelulares. Luego, los núcleos pueden aislarse mediante un simple paso de centrifugación, ya que poseen una densidad mayor que la solución de lisis. La centrifugación se utiliza para separar estas áreas en función de sus diferencias de densidad para aislar los elementos subcelulares en el núcleo de los del citoplasma. Una vez que la centrifugación ha aislado los diferentes componentes, se utiliza un kit de limpieza de ARN para purificar el contenido de ARN, y se realiza qPCR para validar la calidad de separación, cuantificada por la cantidad de ARN nuclear y citoplasmático en las diferentes fracciones. Se alcanzaron niveles estadísticamente significativos de separación, lo que ilustra la efectividad del protocolo. Además, este sistema se puede adaptar para el aislamiento de diferentes tipos de ARN (total, ARN pequeño, etc.), lo que permite el estudio específico de las interacciones citoplasma-núcleo y ayuda a comprender las diferencias en la función del ARN que residen en el núcleo y el citoplasma.

Introduction

El fraccionamiento celular en componentes subcelulares permite el aislamiento y estudio de dominios bioquímicos definidos y ayuda a determinar la localización de procesos celulares específicos y cómo esto puede afectar su función¹. El aislamiento de ARN de diferentes ubicaciones intracelulares puede permitir una mayor precisión del análisis genético y bioquímico de los eventos a nivel de transcripción y otras interacciones entre el núcleo y el citoplasma, que sirve como el propósito principal del protocolo actual². Este protocolo fue desarrollado para asegurar el aislamiento de ARN citoplasmáticos y nucleares para determinar sus respectivos roles en la exportación nuclear y para comprender cómo la localización subcelular de ARN en el núcleo y el citoplasma puede afectar su función en los procesos celulares. Utilizando materiales de un entorno típico de laboratorio, fue posible lograr el fraccionamiento nuclear y citoplasmático de manera más efectiva y menos costosa que los protocolos previamente establecidos sin poner en peligro la calidad de los resultados³.

Además, el intercambio de moléculas entre el citoplasma y el núcleo se puede estudiar directamente separando estas regiones. Más específicamente, comprender el transcriptoma es esencial para comprender el desarrollo y la enfermedad. Sin embargo, los ARN pueden estar en diferentes niveles de maduración en un momento dado y pueden complicar el análisis posterior. Este protocolo permite la capacidad de aislar ARN de fracciones subcelulares nucleares y citoplasmáticas, lo que puede ayudar en los estudios de ARN y permitir una mejor comprensión de un ARN particular de interés, como la localización de ARN no codificantes o el análisis de uniones de empalme dentro del núcleo.

Este protocolo ha sido optimizado para aislar ARN largos citoplasmáticos y nucleares, incluidos ARNm, ARNr y ARN largos no codificantes (lncRNAs), debido a la selectividad de tamaño de la columna de purificación de ARN utilizada, que puede modificarse para aislar otros ARN de interés. Anteriormente, la función de los ARN largos, como los ARNm y los ARNlnc, dependía en gran medida de su respectiva localización dentro de la célula ^4,5. Por lo tanto, el estudio de la exportación del núcleo a los dominios subcelulares se ha dirigido más hacia la comprensión del papel que la exportación de ARN u otros componentes celulares puede tener en la célula. Los lncRNAs sirven como un excelente ejemplo de esto, ya que su traducción y efectos posteriores dependen en gran medida de la proximidad y las interacciones con otras formas de ARN⁶. Además, el intercambio de elementos celulares entre las regiones nuclear y citoplasmática está relacionado a mecanismos de resistencia a diversos tratamientos contra el cáncer⁷. El aislamiento de compartimentos intracelulares ha permitido el desarrollo de inhibidores de la exportación nuclear, lo que ha disminuido los efectos de los mecanismos de resistencia a diferentes terapias⁸.

Después de separar el ARN nuclear y citoplasmático, se realizan pasos para purificar el ARN de interés. Dado que los kits de purificación de ARN se encuentran comúnmente dentro de los laboratorios y funcionan para purificar y aislar ARN largos, sirven bien al propósito de este protocolo. Para la purificación de ARN, la generación de proporciones 260:280 superiores a 1,8 es fundamental para garantizar la calidad de las muestras para la secuenciación de ARN u otros procedimientos similares que requieren altos niveles de pureza y aislamiento. Los valores irregulares de 260:280 indican contaminación por fenol, lo que demuestra un aislamiento deficiente y produce resultados inexactos⁹.

Una vez que se completa la purificación del ARN y se confirma que los valores de 260:280 están por encima de un rango aceptable, se utilizó qPCR para validar los resultados de aislamiento de las fracciones nucleares y citoplasmáticas. Al hacerlo, se utilizaron cebadores específicos para la región de interés para demostrar los niveles de fraccionamiento nuclear y citoplasmático. En este protocolo, MALAT1 y TUG1 fueron utilizados como marcadores nucleares y citoplasmáticos, respectivamente¹⁰. Juntos, permiten la demostración de altos niveles de fraccionamiento nuclear con MALAT1, mientras que se espera que el fraccionamiento citoplasmático sea bajo. Por el contrario, cuando se utiliza TUG1, se espera que los niveles de fraccionamiento citoplasmático sean más altos que los niveles de fraccionamiento nuclear.

Utilizando este protocolo, fue posible aislar ARN en función de su posición de acción dentro de la célula. Debido al acceso generalizado a muchos materiales y la utilización de solo tampón de lisis y técnicas de centrifugación basadas en la densidad durante este experimento, la aplicabilidad a otros tipos de ARN y otros componentes celulares está muy extendida. Esto puede proporcionar información importante al arrojar luz sobre eventos de expresión específicos de la ubicación que de otro modo serían indistinguibles sin separación.

Protocol

Las células K562 se utilizan para el presente estudio. Este protocolo ha sido optimizado para funcionar para 1 x 10 6-5 x 106 millones de células. Sin embargo, el procedimiento se puede ampliar para cantidades de celdas más grandes aumentando los volúmenes adecuadamente. 1. Preparación del tampón de lisis 0.25x Prepare el tampón de lisis 0.25x mezclando los siguientes componentes proporcionados en la Tabla 1A.NOTA: La…

Representative Results

Para asegurar el aislamiento nuclear y citoplasmático, se realizó una qPCR para validar los resultados. Al hacerlo, se utilizaron cebadores específicos de la región de interés para demostrar los niveles de fraccionamiento nuclear y citoplasmático. En este estudio, MALAT1 y TUG1 se utilizaron como cebadores nucleares y citoplasmáticos, respectivamente. Juntos, permiten la demostración de altos niveles de fraccionamiento nuclear con MALAT1 como un control positivo para elementos nucleares, mientras que se espera qu…

Discussion

A lo largo del protocolo, se tomaron algunas medidas para optimizar los elementos para que sean más efectivos para la línea celular de interés. Si bien los pasos dentro del protocolo son relativamente sencillos, puede ser necesario un análisis y ajustes menores durante los aspectos críticos del protocolo. El paso más crítico en el protocolo es modificar la concentración del tampón de lisis a una concentración adecuada basada en la línea celular de interés y el objetivo celular. Dado que la utilización del ta…

Materials

Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.